17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)水平。

实验原理

17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

17Β-雌二醇(17Β-ESTRADIOL)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于生物炭对鸡粪堆肥过程中17β-雌二醇降解和生物活性的影响研究

天然雌激素中17β-雌二醇（E2）的生物活性最强,粪便中E2的迁移会对人类健康和鱼类繁殖构成潜在威胁。好氧堆肥处理可以使畜禽粪便中一部分E2被微生物降解,但粪便中仍有E2残留。近年来,生物炭作为一种好氧堆肥的添加剂虽被广泛使用,然而目前关于生物炭对畜禽粪便堆肥过程中E2降解和生物活性的影响的研究较少,能否利用生物炭去除畜禽粪便中E2并削弱雌激素生物效应仍需进一步研究。

因此,研究开展两组堆肥试验,一组为鸡粪-玉米秸秆堆肥体系,另一组为鸡粪-玉米秸秆-蘑菇渣堆肥体系,以不添加生物炭的处理为对照（分别为Control1和Control2）,通过向堆肥物料中添加5%、10%和15%（鸡粪干重占比）的小麦秸秆生物炭和稻壳生物炭来研究堆体的理化性质变化、E2降解情况、雌激素对人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）的增殖效应及其影响机制。

主要研究结果如下:1.添加5%、10%、15%的小麦秸秆生物炭和稻壳生物炭均能促进堆体碳氮比（C/N）的下降并减少堆体中氨气（NH3）的排放。在鸡粪-玉米秸秆堆肥体系和鸡粪-玉米秸秆-蘑菇渣堆肥体系中,添加两种生物炭的堆体的C/N减少量达6.59～9.26,高于相应对照;与Control1和Control2相比,添加两种生物炭可使堆体平均每天排放的NH3浓度降低13.71%～89.34%,且相同添加比例下使用比表面积和孔容更大的稻壳生物炭对NH3挥发的抑制作用更强,可以得出添加15%的稻壳生物炭更有利于抑制堆体中NH3的排放。

2. 生物炭的添加促进堆体中E2的降解,当小麦秸秆生物炭和稻壳生物炭的添加比例为15%时,堆体中E2浓度下降的比例。堆肥期间,鸡粪-玉米秸秆堆肥体系中添加两种生物炭的堆体的E2含量降低了70.72%～78.04%,高于Control1的下降比例（69.64%）;鸡粪-玉米秸秆-蘑菇渣堆肥体系中添加两种生物炭的堆体的E2含量降低了73.52%～88.08%,高于Control2的下降比例（67.76%）。

3.生物炭的添加促进堆体中三种E2降解菌（Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Rhodococcus equi）的生长。在鸡粪-玉米秸秆堆肥体系和鸡粪-玉米秸秆-蘑菇渣堆肥体系中,添加两种生物炭能够显著（p<0.05）增加三种E2降解菌的总相对丰度。当生物炭添加比例相同时,使用稻壳生物炭的堆体中三种E2降解菌的总相对丰度高于使用小麦秸秆生物炭的堆体中三种E2降解菌的总相对丰度。

参考文献

[1]Influence of biochar on physico-chemical and microbial community during swine manure composting process[J].Balasubramani Ravindran,Dinh Duc Nguyen,Dhiraj Kumar Chaudhary,Soon Woong Chang,Jaisoo Kim,Sang Ryong Lee,JoungDu Shin,Byong-Hun Jeon,SeokJoo Chung,JaeJoung Lee.Journal of Environmental Management.2019

[2]Effects of biochar size and type on gaseous emissions during pig manure/wheat straw aerobic composting:Insights into multivariate-microscale characterization and microbial mechanism[J].Xueqin He,Hongjie Yin,Lujia Han,Ruxiu Cui,Chen Fang,Guangqun Huang.Bioresource Technology.2018

[3]Estrogen:The necessary evil for human health,and ways to tame it[J].Seema Patel,Ahmad Homaei,Akondi Butchi Raju,Biswa Ranjan Meher.Biomedicine&Pharmacotherapy.2018

[4]Combining biochar,zeolite and wood vinegar for composting of pig manure:The effect on greenhouse gas emission and nitrogen conservation[J].Quan Wang,Mukesh Kumar Awasthi,Xiuna Ren,Junchao Zhao,Ronghua Li,Zhen Wang,Meijing Wang,Hongyu Chen,Zengqiang Zhang.Waste Management.2018

[5]荣荣.生物炭对鸡粪堆肥过程中17β-雌二醇降解和生物活性的影响研究[D].海南大学,2019.