大鼠载脂蛋白E(APO-E)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠载脂蛋白E(APO-E)ELISA KIT运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体样本中载脂蛋白E(APO-E)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠载脂蛋白E(Apo-E)ELISA试剂盒水平。用纯化的大鼠载脂蛋白E(Apo-E)ELISA试剂盒抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入载脂蛋白E(Apo-E)ELISA试剂盒，再与HRP标记的载脂蛋白E(Apo-E)ELISA试剂盒抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的载脂蛋白E(Apo-E)ELISA试剂盒呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠载脂蛋白E(Apo-E)浓度。

大鼠载脂蛋白E(APO-E)ELISA KIT

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于大鼠脑损伤后apo E和β-APP时序性表达的研究

选用健康成年雄性SD大鼠,采用改进的Edward自由落体撞击仪复制中度脑挫伤模型,通过常规苏木素-伊红染色技术（hematoxylin and eosin,HE）对大鼠中度脑挫伤后14d内继发性脑损伤的病理学改变、apo E和β-APP的时序及空间分布特征进行光镜观察,同时运用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化酶连接法（Streptavidin Peroxidase Conjunction Method,SP）,并结合计算机图象分析技术,对apo E和β-APP表达变化的规律与脑损伤时间的关系进行定量分析。

实验组用自由落体撞击法形成大脑右顶叶中度脑挫伤后,按不同的预定时间段（0.5h、2h、6h、12h、24h、3d、7d和14d,）分批处死动物（每个时间段取大鼠5只）并立即取出全脑置于4%多聚甲醛溶液（4℃）中固定;假性损伤组经0.4%戊巴比妥钠（用量为:1ml/kg）麻醉后仅行开颅手术而不行落体撞击,并于术后3d处死、取脑;死后损伤组于处死后1h行落体撞击。各组标本均在脑挫伤灶中心旁开2mm处,冠状切取挫伤灶前、后端的脑组织。

标本经取材制片后作apo E和β-APP免疫组化染色观察,同时行HE染色对照。利用计算机图象分析技术,定量测定免疫组化染色切片的阳性细胞平均光密度、阳性细胞百分比及阳性细胞数。所得数据用SAS8.0统计学软件包进行分析。

实验结果显示:（1）脑损伤后0.5h组,脑皮质神经元apo E出现阳性表达,3d达到高峰,随后下降;脑损伤后0.5h组,在海马区出现apo E强阳性反应;CA1区在伤后3d达到高峰,而CA2～CA4区在24h达到高峰,随后逐渐下降;海马区apo E免疫染色强度依次为:CA3>CA4>CA2>CA1。

（2）皮质内β-APP在脑损伤后表达呈一定波动性,0.5h表达明显增加后,逐渐下降,12h降至最低,低于对照组,随后再次出现表达增加,3d达高峰;海马CA1区在脑损伤后24hβ-APP表达开始逐渐下降,3d降至最低,而CA2～CA4区仅在3d组较对照组显著降低,14d均回到对照组水平;齿状回（DG）内β-APP在脑损伤后12h低于对照组。

本实验结果表明:伤后0.5h即出现表达,因此apo E蛋白可作为脑损伤早期诊断一个新的敏感指标;对照组皮质神经元和海马无apo E表达,而伤后才出现表达,也可为法医学上鉴别生前和死后脑损伤提供依据。皮质β-APP及apo E蛋白表达存在一定时续规律性,可望作为法医学上推断脑损伤时间的客观指标之一。

参考文献

[1]Induction of apolipoprotein E after traumatic brain injury in forensic autopsy cases[J].Yoshiyuki Orihara,Ichiro Nakasono.International Journal of Legal Medicine.2002(2)

[2]What the evolution of the amyloid protein precursor supergene family tells us about its function[J].E.J Coulson,K Paliga,K Beyreuther,C.L Masters.Neurochemistry International.2000(3)

[3]Is APOE-ε4 a risk factor for cognitive impairment in normal aging?[J].B.J.Small,A.B.Graves,C.L.McEvoy,F.C.Crawford,M.Mullan,J.A.Mortimer.Neurology.2000(11)

[4]Influence of Apolipoprotein E Genotype on Neuronal Damage and ApoE Immunoreactivity in Human Hippocampus Following Global Ischemia[J].Karen Horsburgh,David I.Graham,Janice Stewart,James A.R.Nicoll.Journal of Neuropathology and Experimental Neurology.1999(3)

[5]何光龙.大鼠脑损伤后apo E和β-APP时序性表达的研究[D].华中科技大学,2006.