兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中NADPH氧化酶1(NOX1)的含量。

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中NADPH氧化酶1(NOX1)水平。用纯化的待测物质抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的待测物质抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中待测物质浓度。

兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒

操作步骤

1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

7、温育：重复4的操作。

8、洗板：重复5的操作。

9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，37℃避光显色15min。

10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。

应用^[4][5]

用于NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎中的表达和意义研究

探讨NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎发病中的表达及意义。方法将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为正常组、1.5%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulphate sodium,DSS）组和3%DSS组,每组10只。正常组正常饮水,1.5%和3%DSS组分别自由饮用含有1.5%或者3%DSS的饮水,共6天建立小鼠急性肠炎模型。通过进行疾病活动指数（Disease Activity Index,DAI）评分、结肠长度测定、血便评分和HE染色等方法评估肠道炎症程度。

利用生化方法检测血清丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量以及结肠组织中氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽（GSSG/GSH）比率等氧化应激指标,以评估机体氧化应激程度。采用免疫组织化学方法和实时定量PCR技术分别检测小鼠结肠组织中NADPH氧化酶Nox1和Duox2蛋白及mRNA的表达情况。

结果1.正常组小鼠无肠炎,1.5%DSS组、3%DSS组小鼠分别呈轻度和重度肠炎:1.5%DSS组、3%DSS组DAI评分与正常组相比均显著增高（P<0.05）;1.5%DSS组和3%DSS组小鼠结肠长度均有不同程度的缩短,其中3%DSS组结肠长度缩短严重（均P<0.05）;正常组小鼠结肠内无血便,1.5%DSS组、3%DSS组结肠内较正常组均有不同程度的血便（均P<0.05）;HE染色评分结果呈现各组炎症程度有明显差别（均P<0.05）。

2. 氧化应激指标（MDA、GSSG/GSH）在1.5%DSS组升高,而3%DSS组进一步升高（均P<0.05）。

3. NADPH氧化酶Nox1与Duox2蛋白和m RNA在不同炎症程度时表达不同:Nox1蛋白和mRNA在正常组呈高表达,在1.5%DSS组表达下调（P<0.05）,在3%DSS组进一步下调（P<0.05）;Duox2蛋白和mRNA在1.5%DSS组表达较正常组明显上调（P<0.05）,而在3%DSS组表达下调至正常水平。

结论Nox1主要在维持肠道黏膜正常防御功能中发挥作用,而Duox2除了维持正常防御功能外,可能还积极地参与肠炎发病过程。

参考文献

[1]Intestinal Inflammation and Mucosal Barrier Function[J].Fermín Sánchez de Medina,Isabel Romero-Calvo,Cristina Mascaraque,Olga Martínez-Augustin.Inflammatory Bowel Diseases.2014(12)

[2]Overproduction of NOX-derived ROS in AML promotes proliferation and is associated with defective oxidative stress signaling[J].Paul S.Hole,Joanna Zabkiewicz,Chinmay Munje,Zarabeth Newton,Lorna Pearn,Paul White,Nuria Marquez,Robert K.Hills,Alan K.Burnett,Alex Tonks,Richard L.Darley.Blood.2013(19)

[3]Vascular peroxidase 1:A novel enzyme in promoting oxidative stress in cardiovascular system[J].Qi-Lin Ma,Guo-Gang Zhang,Jun Peng.Trends in Cardiovascular Medicine.2013(5)

[4]Functional activity and tumor-specific expression of dual oxidase 2in pancreatic cancer cells and human malignancies characterized with a novel monoclonalantibody[J].Yonghzong Wu,Smitha Antony,Stephen Hewitt,Guojian Jiang,Sherry Yang,Jennifer Meitzler,Agnes Juhasz,Jiamo Lu,Han Liu,James Doroshow,Krishnendu Roy.International Journal of Oncology.2013(4)

[5]杨茉莉.NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎中的表达和意义[D].河南科技大学,2015.