兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒的应用
发布日期:2022/3/14 16:24:25
背景[1-3]
兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中NADPH氧化酶1(NOX1)的含量。
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中NADPH氧化酶1(NOX1)水平。用纯化的待测物质抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入待测物质,再与HRP标记的待测物质抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中待测物质浓度。
兔NADPH氧化酶1(NOX1)ELISA试剂盒
操作步骤
1、准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡30分钟。
2、配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
4、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
6、加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50μL,空白对照孔不加。
7、温育:重复4的操作。
8、洗板:重复5的操作。
9、显色:每孔先加入显色剂A液50μL,再加入显色剂B液50μL,37℃避光显色15min。
10、终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。
11、测定:以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。
12、计算:根据标准品的浓度及对应的OD值,计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的OD值,在回归方程上计算出对应的样品浓度,也可以使用各种应用软件来计算。
应用[4][5]
用于NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎中的表达和意义研究
探讨NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎发病中的表达及意义。方法将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为正常组、1.5%葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium,DSS)组和3%DSS组,每组10只。正常组正常饮水,1.5%和3%DSS组分别自由饮用含有1.5%或者3%DSS的饮水,共6天建立小鼠急性肠炎模型。通过进行疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评分、结肠长度测定、血便评分和HE染色等方法评估肠道炎症程度。
利用生化方法检测血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量以及结肠组织中氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)比率等氧化应激指标,以评估机体氧化应激程度。采用免疫组织化学方法和实时定量PCR技术分别检测小鼠结肠组织中NADPH氧化酶Nox1和Duox2蛋白及mRNA的表达情况。
结果1.正常组小鼠无肠炎,1.5%DSS组、3%DSS组小鼠分别呈轻度和重度肠炎:1.5%DSS组、3%DSS组DAI评分与正常组相比均显著增高(P<0.05);1.5%DSS组和3%DSS组小鼠结肠长度均有不同程度的缩短,其中3%DSS组结肠长度缩短严重(均P<0.05);正常组小鼠结肠内无血便,1.5%DSS组、3%DSS组结肠内较正常组均有不同程度的血便(均P<0.05);HE染色评分结果呈现各组炎症程度有明显差别(均P<0.05)。
2. 氧化应激指标(MDA、GSSG/GSH)在1.5%DSS组升高,而3%DSS组进一步升高(均P<0.05)。
3. NADPH氧化酶Nox1与Duox2蛋白和m RNA在不同炎症程度时表达不同:Nox1蛋白和mRNA在正常组呈高表达,在1.5%DSS组表达下调(P<0.05),在3%DSS组进一步下调(P<0.05);Duox2蛋白和mRNA在1.5%DSS组表达较正常组明显上调(P<0.05),而在3%DSS组表达下调至正常水平。
结论Nox1主要在维持肠道黏膜正常防御功能中发挥作用,而Duox2除了维持正常防御功能外,可能还积极地参与肠炎发病过程。
参考文献
[1]Intestinal Inflammation and Mucosal Barrier Function[J].Fermín Sánchez de Medina,Isabel Romero-Calvo,Cristina Mascaraque,Olga Martínez-Augustin.Inflammatory Bowel Diseases.2014(12)
[2]Overproduction of NOX-derived ROS in AML promotes proliferation and is associated with defective oxidative stress signaling[J].Paul S.Hole,Joanna Zabkiewicz,Chinmay Munje,Zarabeth Newton,Lorna Pearn,Paul White,Nuria Marquez,Robert K.Hills,Alan K.Burnett,Alex Tonks,Richard L.Darley.Blood.2013(19)
[3]Vascular peroxidase 1:A novel enzyme in promoting oxidative stress in cardiovascular system[J].Qi-Lin Ma,Guo-Gang Zhang,Jun Peng.Trends in Cardiovascular Medicine.2013(5)
[4]Functional activity and tumor-specific expression of dual oxidase 2in pancreatic cancer cells and human malignancies characterized with a novel monoclonalantibody[J].Yonghzong Wu,Smitha Antony,Stephen Hewitt,Guojian Jiang,Sherry Yang,Jennifer Meitzler,Agnes Juhasz,Jiamo Lu,Han Liu,James Doroshow,Krishnendu Roy.International Journal of Oncology.2013(4)
[5]杨茉莉.NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠肠炎中的表达和意义[D].河南科技大学,2015.
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