人甘精胰岛素素(GLARG-INS)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人甘精胰岛素素(GLARG-INS)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甘精胰岛素素(Glarg-ins)水平。

实验原理：用纯化的人甘精胰岛素素(Glarg-ins)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加人甘精胰岛素素(Glarg-ins)，再与HRP标记的甘精胰岛素素(Glarg-ins)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的甘精胰岛素素(Glarg-ins)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中甘精胰岛素素(Glarg-ins)的含量。

人甘精胰岛素素(GLARG-INS)ELISA试剂盒

试剂盒性能

1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.灵敏度：*低检测浓度小于1.0 ng/L。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

样品收集、处理

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

人甘精胰岛素素(Glarg-ins)ELISA试剂盒操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于甘精、地特与人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响研究

探讨甘精、地特与人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响。

方法:1.体外培养3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化成熟后用基础培养基培养24h,以消除分化培养基的影响;接着加入含有1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L人胰岛素（纯品）、甘精胰岛素（纯品及注射液）、地特胰岛素（注射液）的基础培养基培养24 h,并设立基础培养基组为空白对照组,培养24h,用实时定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测脂肪细胞脂联素mRNA水平。

2. 统计学处理:数据用均数±标准差（x±s）表示;多组定量资料的比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验或Dunnet’s法。P≤0.05认为差异具有统计学意义。

结果:1.不同浓度相同胰岛素对脂联素mRNA表达的影响:不同浓度（1、10、100、1000）nmol/L的各种胰岛素作用于成熟的3T3-L1脂肪细胞24h,随着胰岛素浓度的增加,脂联素mRNA的表达逐渐降低。胰岛素浓度≤10nmol/L时,脂联素表达的降低没有统计学意义（P>0.05）;浓度≥100nmol/L时,脂联素的表达明显降低,具有统计学意义（P<0.05）,且1000nmol/L胰岛素的抑制作用强于100nmol/L胰岛素。

3. 相同浓度不同胰岛素对脂联素mRNA表达影响的比较:1～10nmol/L各组间比较无差别。100nmol/L、1000nmol/L地特胰岛素（注射液）的抑制作用弱于甘精胰岛素（纯品及注射液）及人胰岛素（纯品）;甘精胰岛素（纯品及注射液）的抑制作用弱于人胰岛素（纯品）;甘精纯品与甘精注射液组相比无差别。

结论:1.高浓度（100nmol/L、1000nmol/L）甘精、地特、人胰岛素均不同程度地抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA的表达,且呈剂量依赖性。2.地特胰岛素的抑制作用弱于甘精胰岛素及人胰岛素;甘精胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素。

参考文献

[1]Circulating Adiponectin Is Associated with Obesity and Serum Lipids in West Africans[J].Katherine G.Meilleur,Ayo Doumatey,Hanxia Huang,Bashira Charles,Guanjie Chen,Jie Zhou,Daniel Shriner,Adebowale Adeyemo,Charles Rotimi.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2010(7)

[2]The Road From Discovery to Clinic:Adiponectin as a Biomarker of Metabolic Status[J].C M Kusminski,P E Scherer.Clinical Pharmacology&Therapeutics.2009(6)

[3]Adipocytokines and Insulin Resistance:The possible role of lipocalin-2,retinol binding protein-4,and adiponectin[J].Esteve,Eduardo,Ricart,Wifredo,Fernández-Real,JoséManuel.Diabetes Care.2009

[4]Resistin induces insulin resistance by both AMPK-dependent and AMPK-independent mechanisms in HepG2 cells[J].Zhaofan Luo,Ying Zhang,Fangping Li,Juan He,Helin Ding,Li Yan,Hua Cheng.Endocrine.2009(1)

[5]梁玉.甘精、地特与人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响[D].山西医科大学,2011.