CDNA第一链合成试剂盒的应用

背景^[1-3]

CDNA链合成试剂盒提供合成cDNA链所需要的全部试剂。CDNA链合成试剂盒是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™II M-MLV反转录酶(RNase H-)，用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA链的试剂盒。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MuLV RT)高效合成mRNA的全长cDNA拷贝。使用本试剂盒合成的链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。

产品特点：

1.使用突变的反转录酶，内源RNase H活性低。

2.最长可合成13Kb的cDNA。

3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA专一性引物三种引物(前两种本试剂盒提供)。

4.总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作为模板。

5.可用于cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。

CDNA链合成试剂盒

使用方法：

合成PCR用的1st-strand cDNA

1.配制RT反应体系：

RNA模板：总RNA 100～500ng；引物：Oligo(dT)18(0.5μg/μL) 1μL或随机引物(0.2μg/μL) 1μL；或RNA模板专一性引物 15-20pmol

2.70℃保温5分钟后立即冰浴。

3.再加入5μL RT Buffer(含dNTP)。

4.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃5分钟。

5.加入2μL MMLV逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。

6.42℃保温60分钟(但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT反应。

7.70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。

应用^[4][5]

用于拟穴青蟹fruitless基因鉴定及在性腺发育中的表达与调控研究

通过筛查拟穴青蟹转录组数据,得到了2个fruitless基因Spfru1和Spfru2及与后者相关的一个miRNA,Spfru1含有2个可变剪接体:Spfru1-a和Spfru1-b,通过RT-PCR技术检测了Spfru1-a、Spfru1-b和Spfru2在青蟹不同组织、性腺不同发育时期和不同交配状态中的时空表达特征,再通过荧光原位杂交实验对其进行性腺组织定位。最后通过沉默与过表达miRNA,初步研究了novel＿miRNA-35与靶基因Spfru2的调控关系。

主要结果和结论如下:1.经过克隆得到Spfru1-a cDNA全长为3784bp,共编码878个氨基酸;Spfru1-b cDNA全长为3178bp,共编码475个氨基酸;Spfru2 cDNA全长为4487bp,一共编码了543个氨基酸。通过序列比对,发现Spfru1-a的前1747bp和Spfru1-b前1141bp序列不同,但两个可变剪切体后2037bp序列完全相同,序列一致性为64.98%。Spfru1-a蛋白序列的前517AA和Spfru1-b蛋白序列的前114AA序列不同,但Spfru和Spfru1-b的蛋白序列后361AA序列完全相同,两个可变剪接体的蛋白质序列一致性为42.03%。结构域预测结果显示,Spfru1-a、Spfru1-b和Spfru2均包含保守的BTB结构域,Spfru1-a包含2个C2H2-Zn F区域,Spfru1-b包含3个C2H2-Zn F区域,Spfru2缺乏C2H2-Zn F区域,但包含一个BEN结构域。以BTB结构域序列构建的进化树的结果显示,昆虫纲的Fru聚为一支,而甲壳动物的Fru聚为一支,且Spfru1与Spfru2的距离最近,Spfru1和Spfru2则与中华绒螯蟹的距离最近。

2. RT-PCR的结果显示,Spfru1-a、Spfru1-b和Spfru2在拟穴青蟹不同组织中均有不同程度表达,Spfru1-a和Spfru2在卵巢中的表达量显著高于其它所有组织,Spfru1-a还在雌性胸神经节、肠和肌肉中的表达量显著高于雄性,Spfru1-b在精巢中的表达量显著高于其它所有组织（P<0.05）。Spfru1-a在卵巢Ⅰ期到Ⅲ期的表达量较高,到卵巢Ⅳ期和卵巢Ⅴ期,表达量开始下降,在精巢三个时期表达均相对较低;Spfru1-b在卵巢Ⅰ期到卵巢Ⅳ期的表达量较高,在卵巢Ⅴ期的表达量大幅下降,在精巢Ⅰ期、精巢Ⅱ期和精巢Ⅲ期中表达水平呈上升趋势,尤其精巢Ⅱ期到精巢Ⅲ期的过程中,Spfru1-b的表达水平急剧上升,在精巢Ⅲ期超过卵巢的表达水平;不同发育时期性腺的表达结果显示,Spfru2在卵巢Ⅰ期到Ⅳ期的表达量较高,在精巢三个时期表达均相对较低,因此猜测Spfru1-a、Spfru1-b和Spfru2可能在拟穴青蟹卵巢的发育和成熟中起到重要的作用,Spfru1-a还可能参与调节神经细胞的发育,Spfru1-b可能在拟穴青蟹精巢的发育和成熟中也起到关键性的作用。

在雄蟹中,Spfru1-a和Spfru1-b在未交配到在交配前的过程中,Spfru1-b的表达水平急剧上升（P<0.05）,在交配后表达水平下降到与未交配状态的表达量接近,因此猜测,Spfru1-a和Spfru1-b可能参与调控雄性拟穴青蟹的求偶交配行为。在雌蟹中,Spfru1-a的表达水平呈上升趋势,尤其从交配后一天到交配后三天的过程中,其表达水平急剧上升;Spfru1-b在未交配到在交配前的过程中表达水平呈下降趋势（P<0.05）,在交配后Spfru1-b的表达上升到与未交配状态的表达水平相同;Spfru2在雌蟹从未交配和交配前的表达水平无显著差异且相对较低,但从交配前到交配后三天的过程中,其表达水平呈上升趋势（P<0.05）;一方面,由于卵巢Ⅰ期的细胞发育处于相对慢速发育期,雌蟹在生殖蜕壳并且交配后,卵巢细胞开始进入快速发育期,因此猜测Spfru1-a和Spfru2可能在启动卵巢快速发育和成熟的过程中到发挥重要作用,另一方面,fruitless基因可能参与调控雌蟹的求偶交配行为。荧光原位杂交的结果显示,在精巢中,Spfru1-a和Spfru2的m RNA定位在精子细胞和生精管上皮,Spfru1-b定位在精子细胞;在卵巢中,Spfru1-a、Spfru1-b和Spfru2的m RNA定位在卵母细胞的细胞质中。

3.序列比对发现,novel＿miRNA-35的种子序列与Spfru2的3’UTR碱基互补配对,荧光定量检测结果显示,novel＿miRNA-35在性腺不同发育时期中的表达水平具有显著的差异,在性腺中,Spfru2和novel＿miRNA-35的表达呈现相反趋势。进一步对novel＿miRNA-35进行过表达和沉默干扰,结果显示,在这两种过程中,Spfru2和novel＿miRNA-35的表达变化均呈现出相反的趋势,因此猜测Spfru2是novel＿miRNA-35的靶基因,并且novel＿miRNA-35可能通过种子序列与Spfru2的3’UTR互补结合发挥负调控作用。

参考文献

[1]Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary,hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab,Scylla paramamosain[J].Qingyang Wu,Khor Waiho,Zhi Huang,Shengkang Li,Huaiping Zheng,Yueling Zhang,Mhd Ikhwanuddin,Feng Lin,Hongyu Ma.Aquaculture.2020(C)

[2]Gonadal microRNA Expression Profiles and Their Potential Role in Sex Differentiation and Gonadal Maturation of Mud Crab Scylla paramamosain.[J].Waiho Khor,Fazhan Hanafiah,Zhang Yin,Zhang Yueling,Li Shengkang,Zheng Huaiping,Liu Wenhua,Ikhwanuddin Mhd,Ma Hongyu.Marine biotechnology（New York,N.Y.）.2019(3)

[3]MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases:An Overview.[J].Vishnoi Anchal,Rani Sweta.Methods in molecular biology（Clifton,N.J.）.2017

[4]Gonadal development in males of the orange mud crab,Scylla olivacea（Herbst,1796）（Decapoda,Brachyura,?Portunidae）[J].Waiho K.,Fazhan H.,Jasmani S.,Ikhwanuddin M..Crustaceana.2017(1)

[5]邱必巡.拟穴青蟹fruitless基因鉴定及在性腺发育中的表达与调控研究[D].汕头大学,2021.