大鼠辅脂酶(COLIPASE)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠辅脂酶(COLIPASE)ELISA试剂盒可以用于血清、血浆、组织等样本中辅脂酶(COLIPASE)的含量检测。

试验原理：

大鼠辅脂酶(colipase)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

大鼠辅脂酶(COLIPASE)ELISA试剂盒

大鼠辅脂酶(colipase)ELISA试剂盒操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人类新细胞因子筛选及功能研究——人CLPSL3及其同源基因克隆和功能筛选研究

功能基因组学已成为生物学和医学研究的重点。本室（国家人类基因组北方研究中心）经过序列校正与分析,已构建了1000个以上未知功能基因为主的人类基因全长ORF及其不同剪接体的真核表达文库。

对其中的一员hCLPSL3进行了克隆与功能研究工作。

通过DNAman、DNAstar等生物信息学软件分析预测hCLPSL3基因的核酸及蛋白序列,信号肽,跨膜结构域,同源性,定位等。利用RT-PCR技术分析hCLPSL3基因的细胞表达谱。利用分子克隆技术将基因hCLPSL3插入到真核表达载体PCDNA3.1B（-）-myc-his（以下简称pcDB）、pEGFPNl上。双荧光素酶报告基因系统对hCLPSL3基因进行包括CRE、AP-1、NF-κB和P53等信号转导通路的细胞筛选。cck8检测细胞增殖,绘制生长曲线。Western blot检测hCLPSL3蛋白表达与分泌。CLPSL3是一个没有系统性功能报道的新基因,定位于人染色体12q24.33区域,其开放读码框编码一个由159个氨基酸组成的蛋白质。生物信息分析显示该蛋白质的N端有一次跨膜结构,有明显的信号肽。

利用生物信息学分析结合RT-PCR验证,我们成功克隆到一个新的人类编码基因,因其编码产物含有辅脂酶样结构域,且由于国际核酸序列数据库中已存在另两个辅脂酶样蛋白质的编码基因C6ORF126（本文称为CLPSL1）和C6ORF127（本文称为CLPSL2）,所以将新克隆的基因命名为人辅酯酶样3（human colipase-like3,hCLPSL3）。

通过同源性分析,预测并最终成功克隆到小鼠、大鼠CLPSL3同源cDNA。CLPSL3在哺乳动物中广泛存在,均含有高度保守的18个半胱氨酸,推测与二硫键形成有关,且基因结构相似。构建了hCLPSL3的真核表达载体。通过在人293T细胞中过表达方式证实了hCLPSL3能够分泌。hCLPSL3与大鼠、小鼠的同源性较高,存在其部分组织和人类细胞中,与细胞生长无关,该蛋白为分泌蛋白。这些工作为hCLPSL3的进一步功能研究奠定了基础。

参考文献

[1]Identification of C1qTNF-related protein 4 as a potential cytokine that stimulates the STAT3 and NF-κB pathways and promotes cell survival in human cancer cells[J].Qi Li,Lanlan Wang,Weifeng Tan,Zhi Peng,Yang Luo,Yingmei Zhang,Guoying Zhang,Daxiang Na,Peng Jin,Taiping Shi,Dalong Ma,Lu Wang.Cancer Letters.2011(2)

[2]Human TMEM174 that is highly expressed in kidney tissue activates AP-1 and promotes cell proliferation[J].Pingzhang Wang,Bo Sun,Dongxia Hao,Xiujun Zhang,Taiping Shi,Dalong Ma.Biochemical and Biophysical Research Communications.2010(4)

[3]Signal peptide prediction based on analysis of experimentally verified cleavage sites[J].ZeminZhang,William J.Henzel.Protein Science.2009(10)

[4]Recognition and elimination of nonsense mRNA[J].Oliver Mühlemann,Andrea B.Eberle,Lukas Stalder,Rodolfo Zamudio Orozco.BBA-Gene Regulatory Mechanisms.2008(9)

[5]卢艳.人类新细胞因子筛选及功能研究[D].大连工业大学,2012.