人DNA甲基化转移酶1(DNMT1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人DNA甲基化转移酶1(DNMT1)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人DNA甲基化转移酶1（DNMT1）的含量。检测范围：0.25 ng/ml–8 ng/ml，灵敏度：最低检测浓度小于0.1 ng/ml。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人DNA甲基化转移酶1（DNMT1）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人DNA甲基化转移酶1（DNMT1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人DNA甲基化转移酶1(DNMT1)ELISA试剂盒

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究

通过建立糖尿病小鼠模型和利用体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96,首先,从组织水平观察糖尿病小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3的表达情况及髓鞘结构变化;然后,从细胞水平观察体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96中BDNF及Neurotrophin 3在m RNA及蛋白水平的表达变化,进一步检测BDNF启动子DNA的甲基化状态及DNA甲基转移酶DNMT的表达变化情况。

同时应用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）和特异性DNMT1 sh RNA质粒进行干预,观察DNMT1和BDNF的表达变化情况;最后,检测mTOR信号通路及其上游Akt、AMPK通路对高糖诱导的RSC96细胞中DNMT1和BDNF表达的影响。从而系统探究了DNA甲基化以及Akt/mTOR信号通路对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响,为糖尿病周围神经病变的预防和治疗提供新的研究思路,探索新的治疗干预靶点。

方法:1.BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化将CD1雄性小鼠随机分为两组:正常组（normal mice）和糖尿病组（diabetic mice）。糖尿病小鼠模型构建采用腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,溶于0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,p H 4.4,150 mg/kg）,正常组小鼠只注射相等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,72 h后尾尖取血测定血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L者定义为糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠成模后,每周检测血糖,不符合标准者弃去,喂养16周,处死小鼠,分离坐骨神经,固定于4%多聚甲醛或4%戊二醛,用于免疫组织化学、神经髓鞘固蓝染色及电镜技术检测;部分坐骨神经组织用于提取蛋白。

免疫组织化学和Western blot检测坐骨神经BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达。神经髓鞘固蓝染色及电镜技术观察小鼠坐骨神经髓鞘结构变化。

2. 体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测大鼠雪旺氏细胞系RSC96在37℃,5%CO2培养箱内,用添加有10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基中培养。

3. 检测高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达变化:将RSC96细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose,normal glucose,N）、高糖组（25mmol/L glucose,high glucose,H）和甘露醇高渗对照组（5.5 mmol/L glucose+19.5 mmol/L mannitol,M）。实验前细胞在无血清培养基中培养,以使其同步化。给予相应刺激1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF、Neurotrophin 3蛋白表达,Real-time PCR检测BDNF m RNA表达。

参考文献

[1]Overexpression of P2X4 receptor in Schwann cells promotes motor and sensory functional recovery and remyelination via BDNF secretion after nerve injury[J].Wen‐Feng Su,Fan Wu,Zi‐Han Jin,Yun Gu,Ying‐Ting Chen,Ying Fei,Hui Chen,Ya‐Xian Wang,Ling‐Yan Xing,Ya‐Yu Zhao,Ying Yuan,Xin Tang,Gang Chen.Glia.2019(1)

[2]Cell‐and tissue‐specific epigenetic changes associated with chronic inflammation in insulin resistance and type 2 diabetes mellitus[J].Velosha Naidoo,Merusha Naidoo,Meenu Ghai.Scandinavian Journal of Immunology.2018(6)

[3]DNA Methylation Clocks in Aging:Categories,Causes,and Consequences[J].Adam E.Field,Neil A.Robertson,Tina Wang,Aaron Havas,Trey Ideker,Peter D.Adams.Molecular Cell.2018(6)

[4]Hyperglycemia-induced Bcl-2/Bax-mediated apoptosis of Schwann cells via mTORC1/S6K1 inhibition in diabetic peripheral neuropathy[J].Lin Zhu,Jun Hao,Meijuan Cheng,Cuihong Zhang,Chunxiu Huo,Yaping Liu,Wei Du,Xianghong Zhang.Experimental Cell Research.2018(2)

[5]张翠红.DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究[D].河北医科大学,2020.