大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清，血浆,组织及相关液体样本中嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）水平。用纯化的大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP），再与HRP标记的嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）含量。

大鼠嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于辣椒素对变应性鼻炎大鼠鼻粘膜P物质的表达及其作用的影响研究

以变应性鼻炎（Allergic rhinitis AR）SD大鼠动物模型为基础,观察辣椒素对变应性鼻炎大鼠症状、鼻粘膜形态、P物质的表达及其作用的影响,从而探讨辣椒素在变应性鼻炎防治中的作用机制。

方法1.选取30只健康SD雄性大鼠,每只重量在180220 g,随机分为正常对照组、AR组、辣椒素干预组,每组10只。AR组及辣椒素干预组采用卵清蛋白（Ovalbumin OVA）0.3mg加佐剂Al（OH）330mg、生理盐水1ml混合制成混悬液,进行SD大鼠腹腔内注射,每间隔1日进行1次,正常对照组以等量生理盐水代替,共注射7次。末次激发后30分钟内对SD大鼠的搔鼻、鼻溢、喷嚏等行为进行观察,采用叠加量化法进行症状评分,>5分表示造模成功;

2. 造模成功后,正常对照组、AR组小鼠每日予以生理盐水滴鼻,辣椒素干预组小鼠每日予以辣椒素滴鼻,共15天;

3. 末次滴鼻后24小时内再次进行症状评分并采集适量SD大鼠鼻腔粘膜组织,进行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色观察SD大鼠鼻腔粘膜嗜酸性粒细胞浸润程度、毛细血管扩张充血程度、肥大细胞及P物质含量;

4. 采用ELISA试剂盒检测三组大鼠血清免疫球蛋白（Ig E）、卵清蛋白特异性免疫球蛋白（OVA-s Ig E）、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白含量（ECP）。

结果1.AR组与辣椒素干预组SD大鼠于末次鼻腔激发后30min内均出现打喷嚏、流清涕、易怒好动、骚鼻、挠痒等现象,症状学评分>5分,AR组出现症状10只,辣椒素治疗组出现症状10只,两组均造模成功,正常对照组未出现打喷嚏等AR表现。于辣椒素治疗15天后再次观察记录上述打喷嚏、流清涕等AR症状,AR组症状明显缓解为2只（20%）,辣椒素治疗组症状明显缓解为8只（80%）,差异有统计学意义,（χ2=7.2000,P=0.005<0.05）。通过AR的症状学评分可知:末次鼻腔激发后30min内AR组SD大鼠评分平均为（6.9±0.99）分,辣椒素治疗组SD大鼠评分平均为（7.1±0.73）分。辣椒素治疗15天后,AR组SD大鼠评分平均为（6.40±1.42）分,辣椒素治疗组SD大鼠评分平均为（4.10±1.66）,正常对照组为（0.90±0.31）分。AR组治疗前后无明显变化,差异无统计学意义（t=1.627,P=0.138>0.05）,辣椒素治疗组治疗后症状评分降低,差异有统计学意义（t=5.809,P<0.001）。

2. HE染色见正常对照组鼻粘膜组织结构正常,未见炎性细胞浸润。AR组黏膜连续性中断,纤毛出现倒伏甚至脱落,嗜酸性粒细胞、肥大细胞明显浸润。辣椒素治疗组,粘膜上皮损伤情况明显好转,肥大的杯状细胞减少,腺体和扩张的腺管类似正常对照组,在固有层,炎症细胞明显减少,但没有完全消除。

3. 甲苯胺蓝染色后,肥大细胞计数,AR组肥大细胞计数较正常对照组增多,P<0.05,结果有统计学意义。辣椒素治疗组肥大细胞计数较AR组明显减少,P<0.05,结果有统计学意义。

4.免疫组织化学染色测定AR组鼻粘膜P物质含量较正常组增多,差异具有统计学意义（P<0.05）,辣椒素治疗组鼻粘膜P物质含量较AR组减少,差异具有统计学意义。5.ELISA检测结果示辣椒素治疗组与AR组相比,血清Ig E、ECP、OVA-s Ig E降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。

参考文献

[1]Biological Activities of Red Pepper（Capsicum annuum）and Its Pungent Principle Capsaicin:A Review[J].Krishnapura Srinivasan.Critical Reviews in Food Science and Nutrition.2016(9)

[2]Immunotherapy for glioblastoma:concepts and challenges[J].Tobias Weiss,Michael Weller,Patrick Roth.Current Opinion in Neurology.2015(6)

[3]Asthma with allergic rhinitis management in China:a nationwide survey of respiratory specialists at tertiary hospitals[J].Nan Su,Jiangtao Lin,Guoliang Liu,Kaisheng Yin,Xin Zhou,Huahao Shen,Ping Chen,Rongchang Chen,Chuntao Liu,Changgui Wu,Jianping Zhao,Yanping Lin.International Forum of Allergy and Rhinology.2015(3)

[4]Historical perspectives of allergy and immunology and allergen immunotherapy[J].Richard F.Lockey.Annals of Allergy,Asthma&Immunology.2014

[5]王武臣.辣椒素对变应性鼻炎大鼠鼻粘膜P物质的表达及其作用的影响[D].宁夏医科大学,2017.