MADB106大鼠乳腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

MADB106大鼠乳腺癌细胞是由F344大鼠的肺转移瘤分离并建立，主要用于肺转移型乳腺癌的体外药敏研究。

MADB106大鼠乳腺癌细胞

细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于丙泊酚对荷瘤大鼠MADB106肿瘤细胞肺转移及E-cadherin和β-catenin的影响研究

通过MADB106肿瘤细胞肺转移大鼠模型,观察不同剂量丙泊酚对肿瘤肺转移及转移瘤组织E-cadherin和β-catenin表达的影响。

材料和方法1.实验动物、药品和试剂清洁级Fischer344雄性大鼠,12～14周龄,体重200～220g（北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。鼠抗人E-cadherin单克隆抗体（即用型）,鼠抗人β-catenin单克隆抗体（即用型）均购自proteintech-武汉三鹰生物技术有限公司；丙泊酚（英国阿斯利康公司,200mg/20ml,批号JK222）。

2. 肿瘤细胞培养MADB106肿瘤细胞系（武汉大学中国典型培养物保藏中心提供）,MADB106是大鼠乳腺腺癌细胞系的一种选择性变异,经静脉注入Fischer344大鼠循环系统后,只高选择性地种植转移在大鼠肺部。MADB106细胞在RPMI1640培养液（1640基础培养基90%,FBS10%,双抗0.1%）中培养,放于37℃,100%湿度和5%C02的培养箱中培养,并通过使用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。

3. 动物分组和处理40只大鼠随机分为4组：生理盐水组（S组）；脂肪乳剂组（F组）；丙泊酚30mg/kg组（P1组）；丙泊酚50mg/kg组（P2组）,每组10只。1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射后行股静脉置管,经大鼠股静脉持续泵入等容量生理盐水,脂肪乳剂和丙泊酚,维持鼠肛温在36-37℃,呼吸频率约为60次/分,心率320-340次/分左右；给药1小时后经大鼠股静脉注入0.5mL MADB106肿瘤细胞（2×105/ml）,拔除股静脉置管,缝合切口,在SPF级环境中饲养三周。

4. 标本采集及肺部转移瘤计数3周后,1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后摘除眼球放血处死。固定于操作台,行颈部正中切开并气管插管固定。快速打开胸腔分离左右肺。将大鼠置于头高脚低位,经气管插管缓慢注入4%多聚甲醛固定液,待整个肺的下3/4完全膨胀后停止注入固定液,取出全肺,用生理盐水冲洗肺表面,将全肺投入4%多聚甲醛固定液中固定24小时。将固定好的肺组织取出,放在滤纸上吸干表面的固定液后,由两名未参与实验人员直接计数肺表面转移瘤数目,并进行统计。

5. 免疫组化染色标本经石蜡包埋,切成4μm薄片,贴于载玻片上,经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水,蒸馏水洗5min；热修复抗原后自然冷却,PBS洗3次,5min/次；在3%H2O2孵育5-10min消除内源性过氧化酶影响；PBS洗3次,5min/次；滴加正常山羊血清封闭液室温下20-30min,甩去多余液体；滴加一抗4℃过夜；37℃下复温30min；PBS洗3次,5min/次；加生物素化二抗,室温下30min；PBS洗3次,5min/次；DAB显色；蒸馏水冲洗,苏木素复染；脱水、透明、封片。

6.计数肺转移瘤的数量及肺表面结节转移抑制率大鼠饲养3周后处死,切除肺肿瘤组织,置于4%中性福尔马林固定24h,再经70%的酒精脱洗后,计数肺转移瘤的结节数,计算肺表面结节转移抑制率：转移抑制率（%）=（1-用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%。之后常规石蜡包埋,41μm连续切片作免疫组化标记。

参考文献

[1]Wnt signaling induces gene expression of factors associated with bone destruction in lung and breast cancer[J].Rachelle W.Johnson,Alyssa R.Merkel,Jonathan M.Page,Nazanin S.Ruppender,Scott A.Guelcher,Julie A.Sterling.Clinical&Experimental Metastasis.2014(8)

[2]Propofol induces endoplasmic reticulum（ER）stress and apoptosis in lung cancer cell H460[J].Wen-Yao Cui,Yan Liu,Yong-Qiang Zhu,Tao Song,Qiu-Shi Wang.Tumor Biology.2014(6)

[3]Gene of the month:E-cadherin（CDH1）[J].Tamara M H Gall,Adam E Frampton.Journal of Clinical Pathology.2013(11)

[4]Anandamide inhibits the Wnt/β-catenin signalling pathway in human breast cancer MDA MB 231 cells[J].Chiara Laezza,Alba d’Alessandro,Anna Maria Malfitano,Maurizio Bifulco.European Journal of Cancer.2013(8)

[5]汪威.丙泊酚对荷瘤大鼠MADB106肿瘤细胞肺转移及E-cadherin和β-catenin的影响[D].南方医科大学,2015.