MHCC97-L (低转移人肝癌细胞)的应用

背景^[1-3]

MHCC97-L(低转移人肝癌细胞)来源于人肝癌组织低转移上皮样贴壁细胞系。培养条件：DMEM高糖+10%胎牛血清+1%双抗；95%空气，5%二氧化碳；37℃。MHCC97-H、MHCC97-L和MHCC97-LM3都是肝癌细胞衍生的细胞株。为HBV阳性。形态上皮细胞样，贴壁培养基DMEM高糖,90%;FBS,10%复旦大学中山医院肝癌研究所在研究MHCC97时发现其是异质性很强的细胞群。部分细胞有很强的致瘤性和转移力，而部分则较弱。

MHCC97-L(低转移人肝癌细胞)

因此分离建立了高低转移性不同的肝癌细胞株MHCC97-H和MHCC97-L。据报道MHCC97-H存在较高的干细胞样的侧群细胞（sp）。肝癌SP细胞具有极高的致瘤性，并可能和肝癌转移潜能相关。再用人肝癌细胞株MHCC97-H接种裸鼠，进行3次肺转移筛选，取肺转移瘤建成皮下接种后高度自发性肺转移的肝癌细胞系MHCC97-LM3。

培养操作：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，MHCC97-L低转移人肝癌细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于正常人肝细胞、低转移人肝癌细胞和高转移人肝癌细胞表面岩藻糖含量的变化研究

通过流式细胞仪测定正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株和高转移潜能人肝癌细胞株表面岩藻糖含量的差异,来了解肝细胞型肝癌发生过程中细胞表面岩藻糖含量的变化,以及这种变化与癌变后细胞的转移潜能之间的关系。

[材料和方法]1.研究对象正常人肝细胞株（L-02）、低转移潜能人肝癌细胞株（MHCC97-L）以及高转移潜能人肝癌细胞株（HCCLM3）,以上三株细胞均购于中南大学湘雅中心实验室。将5×106个肝癌细胞接种至裸鼠的皮下,MHCC97-L和MHCCLM3肝癌细胞株的致瘤率均为100%；肝脏原位接种后,MHCC97-L细胞株的腹壁转移率为20%,肝内转移率为0,膈肌转移率为0,肺转移率为40%；肝脏原位接种后,MHCCLM3的腹壁转移率为100%,肝内转移率为100%,膈肌转移率为70%,肺转移率为1000%。

2. 细胞的扩增正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株和高转移潜能人肝癌细胞株,均用含有15%特级胎牛血清的高糖DMEM培养基,于37℃、5%C02及95%湿度的培养箱中静置培养,达到融合生长时,用0.25%的胰蛋白酶消化传代,每株细胞分成7份,分别接种于不同的培养皿中（共3×7=21份）。而后继续用含有15%特级胎牛血清的高糖DMEM培养基,在37℃、5%CO2及95%湿度的培养箱中静置培养,当细胞再次达到融合生长时,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,PBS液洗涤3次,再用PBS液重悬细胞,将细胞浓度均调整为1×106／ml。

3. 实验分组取上述的细胞悬液各500μl,分别加入不同的离心管中,共21管,为样本管。在装有正常人肝细胞（L-02）的7个离心管上依次标明N1-N7,为正常肝细胞组；在装有低转移潜能人肝癌细胞（MHCC97-L）的7个离心管上依次标明L1--L7,为低转移潜能肝癌细胞组；在装有高转移潜能人肝癌细胞（HCCLM3）的7个离心管上依次标明H1-H7,为高转移潜能肝癌细胞组。再用相同的方法取细胞悬液各500μl,分别加入不同的离心管中,在装有正常人肝细胞（L-02）的7个离心管上依次标明CN1-CN7,在装有低转移潜能人肝癌细胞（MHCC97-L）的7个离心管上依次标明CL1一CL7,在装有高转移潜能人肝癌细胞（HCCLM3）的7个离心管上依次标明CH1-CH7,共21管,为流式细胞仪检测过程中样本管的对照管。

4.岩藻糖含量的检测本实验的主要原理是利用荧光标记的荆豆凝聚素（FITC-UEA）能与岩藻糖特异性结合。在暗室内,向样本管（共21管）中加入10μg荧光标记的荆豆凝聚素和PBS液至1000μl；向对照管（共21管）中加入500μl的PBS液至1000μl。样本管和对照管均充分混匀后,立即放置于4℃的环境中,避光孵育1小时。1小时后,取出离心管,用PBS液洗涤细胞2次（800rpm,离心3分钟）,而后加入300μl1%的多聚甲醛溶液固定,再进行荧光显微镜检查和流式细胞仪检测。

参考文献

[1]The emerging importance ofα-L-fucose in human breast cancer:a review.[J].Listinsky Jay J,Siegal Gene P,Listinsky Catherine M.American journal of translational research.2011(4)

[2]Glycan changes:cancer metastasis and anti-cancer vaccines[J].Min Li,Lujun Song,Xinyu Qin.Journal of Biosciences.2010(4)

[3]Cell Coat Mediated Cell Migration[J].Louis T.McLane,Anthony Kramer,Carrie Harris,Edward Park,Hang Lu,Jennifer E.Curtis.Biophysical Journal.2009(3)

[4]Blocking transforming growth factor-beta up-regulates E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.[J].Fransvea Emilia,Angelotti Umberto,Antonaci Salvatore,Giannelli Gianluigi.Hepatology（Baltimore,Md.）.2008(5)

[5]廖晖.正常人肝细胞、低转移人肝癌细胞和高转移人肝癌细胞表面岩藻糖含量的变化[D].南方医科大学,2012.