重组人骨形态发生蛋白2单体的应用

背景^[1][2]

骨形态发生蛋白作为一类可独立诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的细胞因子，是由Urist 在1965 年最初报道的从骨组织中分离出的一种能诱导异位骨及软骨的蛋白质。目前，骨形态发生蛋白家族中已有20 余种蛋白得以分离纯化，其中骨形态发生蛋白2 具有很强的成骨作用，是骨组织工程中最常用的生长因子。

骨形态发生蛋白2 可从骨中分离得到，但是产量极低，每千克皮质骨仅含1.0-2.0 μg 活性蛋白，并且存在感染风险、提纯分离程序复杂、原料来源有限等问题，严重阻碍了其临床应用。重组DNA 技术及分子生物学的迅猛发展，使得人工重组合成骨形态发生蛋白成为现实，它的成功研制为进一步用于骨组织修复奠定了基础。

目前，通过基因工程技术制备的重组人骨形态发生蛋白2单体(recombinant human bonemorphorgeneticprotein-2，rhBMP-2)与天然骨形态发生蛋白2在诱导骨再生过程中作用类似，且rhBMP-2具备诱导成骨时间更早、成骨量较天然骨形态发生蛋白2多、生物学活性好、生物相容性好、成本低等特点，已成为近年来临床骨科创伤疾病防治研究的热点，部分成果已被欧美国家批准用于临床治疗当中。

应用 ^[1]

1.rhBMP-2 具有明确的成骨诱导作用：

rhBMP-2 的成骨诱导能力与骨形态发生蛋白2 类似，而在诱导骨组织形成的时间上rhBMP-2 要明显早于后者，并且其成骨量、血管和骨髓样组织的形成量也明显多于骨形态发生蛋白2。纯化得到的rhBMP-2 能诱导小鼠C2C12 细胞中Smads 和成骨标志蛋白Runx2/Cbfa1 和Osterix转录水平的增加，且无细胞毒性。通过动物实验证明rhBMP-2 能促进兔下颌骨牵引成骨，并且具有浓度依赖性。

碱性磷酸酶和骨的钙化作用密切相关，通过检测碱性磷酸酶含量，可以鉴定rhBMP-2 的诱导成骨作用活性，研究显示rhBMP-2 能显著提高C2Cl2细胞的碱性磷酸酶活性。

2.rhBMP-2 具有良好的生物学活性：

rhBMP-2 的活性程度决定其功能的展现。将rhBMP-2 与配对碱性氨基酸切割酶在中国仓鼠卵细胞内进行共表达，配对碱性氨基酸切割酶可通过提高成熟rhBMP-2 二聚体翻译后修饰活性，提高其真核表达。采用细胞及动物实验对其制备的rhBMP-2 的生物活性进行鉴定，结果表明其具有较好的生物学活性。活性rhBMP-2 的成功制备为进一步临床及科研应用奠定了基础。

3.rhBMP-2 具有良好的生物相容性、安全性：

目前大量动物实验及体外试验研究证实，rhBMP-2 不会引起全身毒性反应、无细胞毒性反应及细胞致突变作用。分别用rhBMP-2 和自体ICBG 结合异体腓骨移植对33 例患者进行颈前路椎间盘切除椎间融合手术，两组患者术后6 个月均获得了影像学融合且未发现内植物相关并发症。术后24 个月，rhBMP-2 组的颈部症状改善和上肢疼痛评分均优于对照组，亦未发现任何并发症或不良反应。

此外，目前尚未发现rhBMP-2对肿瘤细胞的生长有促进作用，这些研究为rhBMP-2能安全有效地用于临床治疗提供了理论依据。rhBMP-2 是应用分子生物学技术将人骨形态发生蛋白DNA编码序列置于包含有选择标记物和启动增强序列的载体内，通过该载体将DNA 编码序列转染至中国仓鼠卵巢细胞，再将这些细胞扩增培养，从而大量提取的。其分离化工艺成熟、原料资源丰富、成本相对较低，可以满足未来大量临床应用及科研需求。

制备^[2]

1）rhBMP-2菌种的制备：中科院遗传与发育生物学研究所戴建武博士组完成质粒重组、细菌转化及单克隆筛选等菌种制备工作，提供了能高效表达包含CBD区域的重组人BMP-2菌种。

2）rhBMP-2高密度发酵：将工程菌无菌操作划平板37 ℃培养12-18 h，以菌落直径1.0-2.0 mm为宜，用接种环挑选单克隆接种于100 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中37 ℃振荡培养4 h，作为一级种子液，将培养好的一级种子液接种于300 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中，37 ℃振荡培养12-18 h，种子A600值应达到4.0-6.0，作为二级种子液。

将二级种子液接种到发酵罐中，37 ℃搅拌培养5 h，至A600值达到20以上时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，相同条下继续诱导培养5 h。培养结束后，离心收集菌体。重悬菌体制成菌悬液，分别采用高速分散器、APV均质机、超声波破碎仪等手段重悬、破碎菌体后，低温高速离心收集包涵体。

3）rhBMP-2的纯化和复性：将包涵体以1 g包涵体：10 mL溶解液的比例溶解于包涵体裂解液中，高速分散器3 000 r/min剪切3 min，然后在恒温摇床中25 ℃温和振荡6 h，12 000×g高速离心30 min，收集上清液，再经0.45 μm滤膜过滤即为包涵体裂解液。

包涵体裂解液分别经过离子交换层析、蛋白复性、肝素亲和层析、凝胶过滤层析等纯化过程得到重组人BMP-2原液，蛋白纯度可达到95%以上。按照《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》对重组人BMP-2原液进行检测，其生物学活性、蛋白质含量、蛋白纯度、分子量、外源性DNA残留量、宿主菌蛋白残留量、残余抗生素活性、细菌内毒素检查、等电点、紫外光谱扫描、肽图、N-末端氨基酸序列均符合规定。

存在问题^[1]

rhBMP-2 强大的成骨诱导能力、良好的生物活性和生物相容性以及相对丰富的原料来源和相对低廉的生产成本使其在骨组织工程领域展现出了广阔的应用前景，因此，将其应用于骨再生具有重大的临床意义。

目前，支持者报道显示rhBMP-2 体外试验无细胞毒性具有良好的生物相容性可供临床应用，其中rhBMP-2 和rhBMP-7 现已被应用于外科整形手术诱导骨再生，但由于rhBMP-2 是外源性细胞生长因子，临床应用多为超生理剂量，故潜在有软组织水肿，皮肤红疹、局部炎症反应、异位骨化和免疫反应等不良后果的危险，所以rhBMP-2 用于人体后的安全性研究还须长期密切关注。

再者，要使rhBMP-2 在临床及科研中达到理想的骨再生效果仍面临一些问题。一方面由于体内蛋白酶和抑制物能将单纯的rhBMP-2 迅速分解稀释。研究表明仅有5%的蛋白会留在植入部位，且植入体内数小时后即可被蛋白酶分解，这就使得rhBMP-2 有效浓度在体内维持时间十分有限，导致其诱导骨形成的能力受到限制。另一方面单纯rhBMP-2 自身不具有填充和支架作用，无法单一在骨缺损处发挥充填、支撑、修补、融合等力学性能，从而严重制约了骨修复作用。rhBMP-2 在体内的迅速扩散分解已经成为其广泛应用的瓶颈。

主要参考资料

[1] 谢兴文, 姜徽, 李宁, 等. 重组人骨形态发生蛋白 2 诱导骨修复的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2013 (7): 1319-1323.

[2] 刘启省, 张东刚. 重组人骨形态发生蛋白 2/骨修复材料的制备与性能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5664-5671.