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尿苷的生产

发布日期:2018/12/6 13:12:13

产品性质

白色针状结晶或粉末,无气味,昧稍甜而微辛。系核苷类的一种,能溶于水,微溶于稀醇,不溶于无水乙醇。

用途和现状【1】

尿苷是构成动物细胞核酸的有关成分,能提高机体抗体水平。动物试验表明尿苷和肌苷等合用能促进心肌细胞代谢,加速蛋白质、核酸生物合成和能量产生,可促进和改善脑细胞代谢。可用于巨型红血球贫血,也可与其他核苷、碱基合用于治疗肝、脑血管及心血管等疾病。

生产方法【2】

发酵法生产尿苷(Uridine,UR)的报道,大约与发酵法生产胞苷的报道近乎在同一时期。20世纪80年代后期至90年代中期日本武田化学工业公司的科学家开始发表这一成果,他们共同研究嘧啶核苷发酵,每个人侧重于不同的一个课题。尿苷足重要的合成药物的中间体,抗肿瘤药物5。氟尿嘧啶,5,氟尿嘧啶核苷,抗病毒药物5一碘脱氧尿苷历来都是以化学全合成制取。如以尿苷为前体经半合成或功能基团置换将大大降低此类药物的生产成本。

以前有些报道使用大肠杆菌、沙门杆菌、产氨短杆菌的变异株产生尿苷酸或尿苷,但产率都不超过59/L的水平,在工业生产上尚不具备价值。也许是同一批人研究了尿苷和胞苷的变育种,他们使用了同一株枯草芽孢杆菌野生菌为母株(No.122),获得了发酵法生产尿苷和胞苷的成功。

(一)尿苷产生菌的诱变育种

1.尿苷产生菌母株的选育

为了获得尿苷发酵产率高的菌株,一定要选择一株嘧啶核苷酸代谢能力较强的菌株,或者称核酸库较大的菌株,按照嘧啶核苷酸生物合成代谢图判断,乳清酸和乳清酸核苷酸是尿苷酸生物合成的中间体。如果选育尿嘧啶缺陷型(U一)变异株则可以在发酵过程中积累乳清酸和乳清酸核苷,能大量积累这两种产物的变异株一定有希望积累大量的尿苷,因为此类菌嘧啶代谢途径相关的酶活性很高,也最合适作为尿苷产生菌的母株。

表8一19显示了野生型芽孢杆菌的尿嘧啶缺陷型变异株产生乳清酸和乳清酸核苷的情况,其中最优秀的菌株为枯草芽孢杆菌No.122(野生型)诱变获得的F一100(U一)产生的乳清酸和乳清酸核苷最高。

2.尿嘧啶缺陷型(U)的性状

图8—14显示尿嘧啶缺陷型菌株AF一100在发酵培养基中添加生长因子尿嘧啶最合适的量是50mg/L,增加量使乳清酸和乳清酸核苷二者的积累量显著下降,这说明尿苷类化合物的生物合成受产物的反馈调控,要选育高产尿苷的菌,必须解除反馈抑制。

3.2一巯基尿嘧啶(2TU)抗性变异株产尿苷

选择3种尿嘧啶结构类似物——2一巯基尿嘧啶、6一杂氮尿嘧啶和5一氟尿嘧啶对枯草芽孢杆菌No.122(野生型)进行生长抑制反应检测,观察到在基本培养基中添加10~10099/ml的每一种药物即引起生长抑制,而在培养基中含100t_tg/ml尿嘧啶时,对2。巯基尿嘧啶和6一杂氮尿嘧啶解除抑制,因此确定此两种结构类似物是合适的分离抗性变异株的制剂。将No.122菌株经诱变后选育抗300/Lg/ml 2一巯基尿嘧啶的突变株,在这些突变株中选育到一株37℃80h发酵产尿苷109/L的抗药性菌株No.258。

4.6一杂氮尿嘧啶抗性变异株提高尿苷产率

上述获得的No.258是一株抗2TU变异株,但该菌株不能在含有lmg/ml的6一杂氮尿嘧啶的基本培养基平板上生长,它对该类似物的生长反应极敏感,因此用此菌株为出发菌,用亚硝基胍(N—methyl.N7一nitro-N—Ni哪dine)为诱变剂,选育抗不同浓度6一杂氮尿嘧啶的变异株,其中No.508变异株能够抗5mg/ml的6一杂氮尿嘧啶,发酵产尿苷469/L。

5.降低尿苷磷酸化酶(Upase)变异株提高尿苷产率

No.508菌株与母株No.258比较,显著提高了尿苷产率,但是副产物尿嘧啶的产率相差无几,仅从79/L下降至69/L。由于副产物的生成不仅使尿苷对糖转化率低,而且在工业生产上提取分离工艺复杂化。No.508除积累尿苷之外尚产生较多尿嘧啶是由于该菌株具有分解尿苷成为尿嘧啶的尿苷磷酸化酶(Upase),为此,从No.508再经过二次诱变和一次转化得到一株缺乏Upase的变异株。

第一步经诱变选育乳清酸核苷酸脱羧酶缺乏的变异株(OMP—Dcase一),它需要尿嘧啶或尿苷维持生长。第二步再诱变Upase缺乏变异株,它在提供尿苷时生长很差,但在尿嘧啶提供时生长很好。第三步经转化方法回复乳清酸核苷酸脱羧酶活性。最终获得的No.556菌,尿苷磷酸化酶活力很低,发酵产生559/L的尿苷而产生很少量尿嘧啶,产物对糖转化率34%。

(二)高产尿苷变异株的遗传性状

枯草芽孢杆菌全合成尿苷的途径见图8—9。在此途径中的终产物尿苷酸(UMP)和尿三磷(UTP)抑制合成过程中的6个酶,尿嘧啶衍生物阻遏这6个酶经过诱变选育抗药性变异株后,尿苷酸调控的6个酶全部被解除了反馈抑制,而且这些酶在变异株中的活性与母株相比提高了16~30倍,而尿苷磷酸化酶只有母株的3/100,因而变异株在一个合适的发酵条件时能大量积累尿苷。变异菌株的遗传图谱及产率见表8—23。

(三)枯草芽孢杆菌尿苷产生菌的最适发酵条件

1.氮源的作用

尿苷是含氮化合物,无论有机氮和无机氮对菌种的生长和核苷的产率有很大影响,现使用变异株No.556,37℃,80h发酵周期,基本培养基(g/d1)为:葡萄糖16;尿素2;CaC030.5;再添加各种有机氮。

最高尿苷产率的有机氮源为C.S.L 4%加C.G.M 0.7%或C.s.L 4%加酪源0.2%。在发酵全过程中,如采用自动流加液氨控制pH7,但尿苷产率并不能达到最高,经分析,必须有一个合适的铵离子浓度使尿苷产率达到最高。

2.碳源的作用

不同碳源的发酵试验和葡萄糖为碳源的浓度试验见表8—26,表8—27。由表8—26,表8—27看出碳源中葡萄糖对产尿苷最佳,初糖浓度18%,尿苷产率和对糖转化率最高。

3.钙化合物对产尿苷的影响

在金属盐试验中,钙盐如CaC03,CaCl2·2H20极大地促进尿苷的产率(表8—28),最适浓度分别是0.5%和0.3%,但同时发现当钙盐被分开消毒时,尿苷产率很低。而钙盐与培养基混合消毒,在培养基中没有磷盐时,尿苷也显著减产。因此认为钙盐与部分磷盐络合,使培养基中存在低浓度的磷离子水平,促进尿苷高产;高浓度的磷盐不仅菌体生长慢且产量降低。

4.pH的影响

发酵期间控制pH6.0~8.0,对尿苷的产率是稳定的,并显现开始12h pH下降到6.0左右,至24h增加到7.0,以后保持不变最佳状态(表8—30)。

5.培养温度的影响

研究了32~42*(2范围内温度不同对尿苷产率的影响,尿苷高产的最适发酵温度是3812,如表8—31。

6.供氧的影响

使用No.556菌株,200L发酵罐进行了不同供养对产生尿苷的影响,培养基中的溶氧值很强烈地影响尿苷的产率,在OTR为20×10_7mol/(n[1l·min)时,尿苷产率最高;当OTR低于15×10。7mol/(ml·min)时,细胞生长在溶氧浓度减少到0状态时,尿苷产率显著降低。

(四)高产尿苷发酵全过程

以抗药性诱变育种为主要目的的枯草芽孢杆菌No.556能够在一个合适培养基中产生大量尿苷。图8—15的过程是在6000L发酵罐装液量为4000L,38℃,搅拌180r/min,通气量为1500L/min时的结果。12h前从培养基中大量释放出铵离子没有尿苷产生,此后随着糖、尿的消耗,几乎是平行地产生尿苷直至75h,最高尿苷达659/L。

参考文献

[1]衷平海,张国文主编,生物化学品生产技术,江西科学技术出版社,2007.5,第205页

[2]焦瑞身主编,微生物工程,化学工业出版社,2003年07月第1版,第179页

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