支原体去除试剂盒的应用

背景^[1-3]

支原体去除试剂盒是一种混合抗生素制剂，含有三种对支原体具有抑菌作用的组分，分别是喹诺酮类、四环素衍生物类和大环内酯类抗生素，可取得良好的支原体清除效果。在细胞培养过程中，定期检测能够有效的避免支原体大量污染，但如果细胞已受支原体污染，则需对其进行及时处理，处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。若受污染的细胞比较珍贵，必须去除支原体污染，可以通过混合使用抗生素以达到目的。由于支原体无细胞壁，因此传统的抗生素一般对其无效。

支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。大小一般在0.3-0.5um之间，缺乏细胞壁呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖，在自然界分布极为广泛。可对人、动物、植物、昆虫等致病，造成极大危害。

支原体

支原体对细胞的影响，主要从两方面考虑：一方面是对细胞的直接影响，细胞被支原体污染后，增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁上脱落，部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际上潜伏着多方面的危险；另一方面，支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗力。总之，支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。

应用^[4][5]

用于Baytril对BHK-21细胞大肠杆菌、猪鼻支原体污染清除研究

细胞培养中的细菌和支原体污染,特别是支原体污染一直都是细胞培养的难题。污染了细菌和支原体的细胞,虽然一般选择废弃,但有些重要的细胞依然需要靠清除污染来挽救。细胞株的微生物污染源一般有细菌、真菌、支原体。细菌和真菌污染细胞培养物时导致培养基变色,镜下可以看到菌体。但细胞株感染支原后培养基通常不会有颜色变化,更不能在普通显微镜下观察到。支原体会影响培养细胞的各项参数,甚至导致细胞株死亡。

鉴于细胞培养的污染清除中存在的诸多问题,本研究以BHK-21细胞、抗菌药Baytril、大肠杆菌、猪鼻支原体为研究对象,用96孔细胞培养板,采用10倍分级稀释法,测出抗菌药Baytril对BHK-21细胞的最小抑制浓度为60-80PPM。用同样方法,测出Baytril对大肠杆菌的最小抑菌浓度是1PPM。而Baytril对猪鼻支原体的最小抑菌浓度是0.5-2PPM[63],所以选定了10PPM这个即不影响BHK-21细胞,又可以抑制大肠杆菌和猪鼻支原体的Baytril浓度来做进一步的实验。在细菌部分的实验里,用含10PPM的抗菌药Baytril的MEM生长液,对用大肠杆菌人工污染的BHK-21细胞里,通过洗涮、冲洗、重点冲洗、刮出、消化、贴壁后再冲洗等循环往复的处理等办法。

在抗菌药Baytril的保护下,大幅度地稀释大肠杆菌在细胞群里面的浓度,同时也在用无抗菌药的培养液做大肠杆菌的监测。监测显示,进行到第4个清污循环时,BHK-21细胞里大肠杆菌的污染已经被彻底清除。在支原体的的实验里,人为感染猪鼻支原体的BHK-21细胞,同样是用含10PPMBaytril抗生素的MEM生长液,同样采用和清除大肠杆菌基本相同的方法。

用DNA荧光染色法和PCR法对猪鼻支原体的清除进行不断监测,结果发现,同样是到了第4轮循环,BHK-21细胞就脱离了支原体的污染,并且PCR法比起DNA荧光染色法要敏感得多。最后通过生物统计学里的配对资料符号检验法检验后得出,本方法对清除BHK-21细胞系中的大肠杆菌、猪鼻支原体感染具有极显著的效果。

参考文献

[1]Treatment of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures with Plasmocin[J].Cord C.Uphoff,Sabine-A.Denkmann,Hans G.Drexler,Elvira Gonzalez De Mejia.<journal-title>Journal of Biomedicine and Biotechnology.2012

[2]PCR-based detection and eradication of mycoplasmal infections from various mammalian cell lines:a local experience[J].Vahid Molla Kazemiha,Mohammad Ali Shokrgozar,Mohammad Reza Arabestani,Morteza Shojaei Moghadam,Shahram Azari,Susan Maleki,Amir Amanzadeh,Mahmood Jeddi Tehrani,Fazel Shokri.Cytotechnology.2009(3)

[3]Highlights of mycoplasma research—An historical perspective[J].Shmuel Razin,Leonard Hayflick.Biologicals.2009(2)

[4]Extracellular DNA in Culture of Primary and Transformed Cells,Infected and Not Infected with Mycoplasma[J].E.S.Morozkin,V.N.Sil’nikov,E.Yu.Rykova,V.V.Vlassov,P.P.Laktionov.Bulletin of Experimental Biology and Medicine.2009(1)

[5]高林.Baytril对BHK-21细胞大肠杆菌、猪鼻支原体污染清除研究[D].甘肃农业大学,2005.