小鼠骨髓基质细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠骨髓基质细胞源自新生的op/op小鼠颅盖。因编码M-CSF的基因中的一个突变，它不能生成有功能的巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)。M-CSF的存在对胚胎干细胞(ES)分化成血细胞而不是其他巨噬细胞有抑制功能。

OP9细胞可以用于与小鼠胚胎干细胞共培养以诱导胚胎干细胞分化成成红血球来源的、骨髓来源的和B细胞谱系的血细胞。与OP9共培养不需要外源的生长因子或复杂的胚胎结构。这个系统对研究造血细胞的发育和分化的分子机理有用。

小鼠骨髓基质细胞

细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM-a（无核苷）培养基；优质胎牛血清，20%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于IL-6在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究

糖皮质激素性骨质疏松症已经成为当今最常见的继发性骨质疏松症。除了疼痛,骨质疏松性骨折导致的活动障碍可进一步引起肺部感染、肌肉萎缩、日常生活不能自理及社会孤立等一系列严重后果。骨质的形成及矿化是由源于骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSC）的成骨细胞定向分化的结果。

构建糖皮质激素性骨质疏松小鼠动物模型（glucocorticoid induced osteoporosis,GIO）:使用泼尼松缓释片皮下埋入4周,骨组织形态学分析、骨密度及血清骨代谢指标检测等方法证实模型成功构建后,于造模成功的小鼠胸腰椎椎体分离BMSC并体外传代培养,骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导其向成骨细胞定向分化。Von Kossa染色法计数成骨细胞克隆数（CFU-OB）,MTT法比较正常小鼠和骨质疏松小鼠BMSC增殖率,定量RT-PCR比较两组RANKL、OPGm RNA表达情况,诱导1周及3周后染色测定成骨分化情况,诱导2周时使用定量RT-PCR比较两组Runx2、OPN、osteocalcin m RNA表达情况。

通过观察证实GIO的BMSC成骨分化障碍。再检测骨代谢相关的指标,发现白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）表达水平异常增高,并进一步对细胞培养体系中加入IL-6中和抗体及慢病毒sh RNA感染下调IL-6表达后,综合使用上述检测方法探讨GIO小鼠椎体BMSC成骨分化障碍的分子机制。最后使用IL-6中和抗体进行小鼠体内治疗,并检测相关成骨分化指标。

实验验证了GIO小鼠椎体BMSC体外增殖减慢且伴成骨分化障碍,并得出以下结论:1、GIO小鼠椎体BMSC IL-6过度分泌,且该情况在使用BMP2诱导成骨时同样存在;

2、IL-6过度分泌是导致GIO小鼠椎体BMSC成骨分化障碍的重要原因;

1. IL-6负性调节Wnt/β-catenin信号通路导致GIO小鼠椎体BMSC的成骨分化障碍;

4、体内使用IL-6中和抗体可改善GIO小鼠的骨质疏松疾病表型本实验加深了对GIO病理生理的认识,提出了在以后的GIO治疗研究中IL-6可作为一个重要的治疗靶点的新观点,为进一步临床开发GIO药物提供了参考

参考文献

[1]Vertebral Fractures:Clinical Importance and Management[J].D.L.Kendler,D.C.Bauer,K.S.Davison,L.Dian,D.A.Hanley,S.T.Harris,M.R.McClung,P.D.Miller,J.T.Schousboe,C.K.Yuen,E.M.Lewiecki.The American Journal of Medicine.2016(2)

[2]Dynamic and distinct histone modifications of osteogenic genes during osteogenic differentiation[J].Zhang Yong-Xing,Sun Hai-Lang,Liang He,Li Kai,Fan Qi-Ming,Zhao Qing-Hua.Journal of Biochemistry.2015(6)

[3]Epigenetic landscape in PPARγ2 in the enhancement of adipogenesis of mouse osteoporotic bone marrow stromal cell[J].Yongxing Zhang,Chao Ma,Xuqiang Liu,Zhenkai Wu,Peng Yan,Nan Ma,Qiming Fan,Qinghua Zhao.BBA-Molecular Basis of Disease.2015(11)

[4]IL-6 negatively regulates osteoblast differentiation through the SHP2/MEK2 and SHP2/Akt2 pathways in vitro[J].Shoichi Kaneshiro,Kosuke Ebina,Kenrin Shi,Chikahisa Higuchi,Makoto Hirao,Michio Okamoto,Kota Koizumi,Tokimitsu Morimoto,Hideki Yoshikawa,Jun Hashimoto.Journal of Bone and Mineral Metabolism.2014(4)

[5]李翔.IL-6在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究[D].苏州大学,2016.