大肠埃希氏菌的检测方法及应用

背景及概述^[1][2]

大肠埃希氏菌简称大肠杆菌，系人和温血动物后肠段正常菌丛的主要成员之一，具有菌体 (O)、荚膜 (K) 和鞭毛 (H) 3种抗原，已确定的O抗原群有164个(序号排至171)、K抗原72个(序号排至103)、H抗原55个(序号排至57)。已知的血清型高达数千种。通常无病原性或为条件致病菌，但数目有限的血清型为初生幼畜腹泻的常见病原菌，它们具有粘着素性菌毛和肠毒素两种致病因子，故名产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)。这类菌毛主要有猪源ETEC的K₈₈(F4)和987P(F₆)以及猪、牛、羊源ETEC的K₉₉ (F₅) 和F41四种，均系蛋白质，能特异地吸附于宿主小肠上皮细胞上。

肠毒素是引起腹泻的直接致病因子，分不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)两种，多数K₈₈+ETEC可产生LT和ST，而具其他粘着素性菌毛者一般只产ST。有上述菌毛的ETEC常与一定的O抗原群相联系。引起断奶仔猪腹泻的大肠杆菌也常局限于某些特定的O抗原群。少数β溶血大肠杆菌能产生神经毒素，是仔猪水肿病病原。本菌对幼兔可致腹泻和败血症;对鸡能引起肠炎、败血症、腹膜炎、气囊炎和肉芽肿；对产卵母鹅和种公鹅可致生殖器官感染。在基因工程中被广泛应用，作为质粒的接受菌和基因表达。

检测^[2]

一、检测水中大肠埃希氏菌的方法

检测大肠埃希氏菌等的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各种样品，但操作复杂，检测时间较长，滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发酵法更为简单，但是不适合检测高浊度和其他复杂水样。这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。

目前，国内外研究人员已经发展了一些新方法进行大肠埃希氏菌等的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术(PCR)、免疫分析法、生物传感器法等。其中酶底物法是已经纳入国标的标准检测方法，聚合酶链反应技术 (PCR)、免疫分析法、生物传感器法等方法还不成熟。与传统方法相比，国标酶底物法虽然将检测时间缩短至24h，但是仍然不能满足快速检测的需要。以酶底物法为原理开发出来的在线实时监测仪器价格昂贵，而且基本上都是以进口产品为主。

CN201410354559.4提供一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，该方法能够快速检测出水中大肠埃希氏菌。提供如下技术方案：

一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，包括如下步骤：

步骤1、提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，浓缩，分别加入到检测培养液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，所述特征时间为各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生 450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和 特征时间的线性方程；

步骤2、将待测水样浓缩，加入步骤1所述检测培养液培养，在其410nm 吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到步骤1中的线性方程中获得待测水样中大肠埃希氏菌的浓度；其中，所述检测培养液包括Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、吐温-80、NaH2PO4·H2O、K2HPO4·3H2O、 邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。

在本检测方法中，只有吸光度有明显变化且荧光强度达到所设定的阈值240，才可认定为存在大肠埃希氏菌，然后通过荧光强度定量检测出水样的大肠埃希氏菌浓度。如果只有吸光度有明显变化，而荧光强度超过10h未达到阈值240，或者只有荧光强度在10h内达到阈值240，但吸光度未有明显变化，则不能认定待测水样中存在大肠埃希氏菌。双标准的选择极大地增加了检测的准确性，杜绝了其他影响因素的干扰。发明基于酶底物法的原理，以吸光度和荧光强 度为标准，采用适合于大肠埃希氏菌的检测培养液，能够快速、准确地检测出水中大肠埃希氏菌的浓度，可实时监测水中微生物污染情况。

应用 ^[3]

2′-脱氧腺苷(2-deoxyadenosine)是天然的脱氧核苷，是脱氧核糖核酸(DNA)的有 机组成部分，也是基因药物和基因工程研究的重要原材料，具有很好的生理活性。2′-脱氧腺苷本身有一定药用价值，可抑制由糖诱导的胰岛素释放，并且能够降低特异性磷酸二脂酶抑制剂或腺苷环化酶激活剂促进胰岛素分泌的作用。虽未有报道其可直接用于抗病毒，但是可作为一种重要的原料，经过化学结构改造得到的2′-脱氧腺苷类似物是很多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病核苷类药物的良好中间体。

CN201410387566提供一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2′-脱氧腺苷。

参考文献

[1] 兽医大辞典

[2]CN201410354559.4 一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液

[3]CN201410387566.4 一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法