土壤DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

土壤DNA提取试剂盒采用脱腐缓冲液系统，可以将土壤样本中的腐殖酸尽可能的去除，并且配有的玻璃珠可有效破碎土壤样本中的各种复杂成分，保证从土壤中提取基因组DNA的完整性。

使用本试剂盒回收的DNA杂质少，完整性好，可直接用于PCR、酶切等其它分子生物学下游实验。

从土壤中提取的DNA，是微生物、动植物遗体等的总DNA，同时，腐殖物质的性质与DNA很相似，DNA提取过程中会将腐殖等物质一起纯化，采用传统的DNA提取方法来除去腐殖物质等抑制因子是十分困难的。而这些腐殖物质会抑制聚合酶链式反应（PCR）及限制性酶切等。因而，从土壤中提取DNA，腐殖物质等抑制因子的除去干净是重中之重。

土壤DNA提取试剂盒

操作步骤：

土壤样品加入悬浮缓冲液Buffer C1，并加入玻璃珠与专利的腐殖酸吸附剂Buffer C2，涡旋使土壤充分重悬，腐殖物质充分释放，让吸附剂有效吸附腐殖酸。

再加入高效的裂解液Buffer C3并涡旋在玻璃珠的摩擦作用下，裂解土壤中的所有生物包括G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫甚至真细菌的孢子、芽孢、动植物遗体等，游离DNA。之后，再加入沉淀剂Buffer C4，离心沉淀除去土壤残渣、吸附有腐殖酸的吸附剂、多糖多酚、绝大部分的色素等，获得清亮的、含有DNA的上清，上清加入异丙醇沉淀获得DNA粗品。

粗品中加入ddH2O溶解后，再加入Buffer C5离心进一步除去腐殖酸等杂质，获得上清，往上清加入乙醇后转移到硅胶纯化柱中过柱吸附DNA，除去杂质。

再加入漂洗液Buffer WB离心进一步除去蛋白质、腐殖酸等杂质，加入漂洗液DNA Wash Buffer除去盐分等。干燥柱子后加入灭菌去离子水后，离心获得高纯的DNA。

应用^[4][5]

用于长期施肥对酸性及中性水稻土壤中氨氧化微生物的影响

以小麦土壤和水稻土壤为研究对象,初步探索了针对风干土壤DNA的提取方法,为对风干土壤进行现代分子生态学分析奠定基础。还以长期施用无机肥（NPK）的酸性水稻土壤和中性水稻土壤为研究对象,利用定量PCR技术研究了长期施肥对土壤中氨氧化古菌（AOA）和细菌（AOB）丰度的影响,利用稳定性同位素示踪技术（SIP）结合DGGE技术研究了长期施肥对AOA和AOB群落结构的影响,利用SIP结合454高通量测序研究长期施肥对活跃AOA和AOB的影响。

研究采用Griffiths方法、冻融法和试剂盒提取法三种DNA提取方法,分别提取了风干的和新鲜的小麦土壤和水稻土壤DNA。研究结果显示,三种方法中试剂盒提取法的提取效果；三次连续提取DNA量占五次连续提取DNA总量的80%以上,三次连续提取能在程度上反映土壤微生物丰度；风干土壤DNA反映的微生物丰度比新鲜土壤DNA反映的微生物丰度低,但风干土壤DNA可以在一定程度上反映新鲜土壤微生物丰度的变化。

酸性、中性土壤中NPK和CK处理AOA的拷贝数均无显著差异,但NPK处理AOB的拷贝数显著高于CK处理。酸性土壤和中性土壤中,AOA拷贝数均高于AOB拷贝数。稻田土壤长期施用无机肥在某种程度上促进了氨氧化细菌的生长。

酸性、中性水稻土壤NPK处理和CK处理的AOA群落结构无显著性差异。添加尿素培养8周后,酸性、中性水稻土壤增加了Group1.1b类群的AOA,AOA群落结构发生变化,但酸性水稻土NPK处理和CK处理间无显著差异,而中性NPK处理和CK处理间存在显著差异。中性水稻土壤NPK和CK处理的AOB群落结构存在显著差异；添加尿素培养8周后,AOB群落结构未发生变化,但是NPK处理和CK处理间的差异仍然存在。

参考文献

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[5]郭赟.长期施肥对酸性及中性水稻土壤中氨氧化微生物的影响[D].南京师范大学,2013.