生物素对L-缬氨酸发酵的影响

L-缬氨酸是人体所必需的8 种氨基酸之一，在人体内有特殊的生理功能，是维持人生命活动的重要物质。微生物发酵法逐渐成为世界范围内生产L-缬氨酸的主要方式，而发酵法生产L-缬氨酸的成本则主要受到发酵水平高低的影响。目前，L-缬氨酸主要利用经代谢工程手段改造之后的谷氨酸棒状杆菌进行发酵生产，而这种方法目前主要面临糖酸转化率不高、主产物积累造成反馈抑制以及副产物丙氨酸中后期积累过多影响最终L-缬氨酸提取的问题。

生物素又称VH、VB7和辅酶R，以多种方式参与谷氨酸棒状杆菌的生长代谢。生物素是整个生物界生长发育所必需的元素，在使用谷氨酸棒状杆菌作为生产菌株发酵生产L-缬氨酸时，生物素添加量直接影响生产菌的生长、增殖和代谢速率，并决定细胞转型的时间及细胞膜的通透性，添加适量的生物素能够使产酸高峰期提前，延长产酸周期，从而提高L-缬氨酸的产率，因此，确定一个合适的生物素添加量是提高L-缬氨酸产率的有效手段。

1 生物素添加量对菌体生长及L-缬氨酸产率的影响

经过14 h的种子培养及52 h的发酵培养，随生物素添加量的增加，菌液OD600 nm分别达到了1.621、1.761、1.768和1.830，L-缬氨酸的最终产量分别达到了48、72、64 g/L和58 g/L。可见生物素添加量对L-缬氨酸产量的影响显著：在发酵培养基中生物素添加量越高，菌体生长越快，最终菌体浓度越高；生物素添加量过高时，菌体生长迅速，发酵前期产酸速率高，中后期产酸速率下降，最终产量降低；生物素添加量为50 μg/L左右时，L-缬氨酸产量最高，菌体量生长适中。

2 生物素添加量对菌体耗糖速率及糖酸转化率的影响

经测算耗糖量，在初糖质量浓度80 g/L的发酵中，随生物素添加量的增加，初糖质量浓度降至10 g/L水平所需发酵时间减少，依次为22、19、18、16.5 h，可见菌体耗糖速率与生物素添加量呈正相关；结果显示，根据每4 h所记录流加糖量，发酵进行至30 h左右时，耗糖进入高峰阶段，菌体生长速率趋于平缓，菌体消耗的葡萄糖更多的用于合成代谢产物，此时L-缬氨酸与L-丙氨酸皆处于快速生成阶段；发酵结束时，生物素添加量由低到高的批次糖酸转化率依次为24%、32%、27%和22%。可见，控制生物素添加量可有效提高L-缬氨酸的生产效率，降低生产成本，提高发酵生产的效益。

3 生物素添加量对副产物L-丙氨酸的影响

结果显示，发酵结束时，随生物素添加量的增加，L-丙氨酸产量分别为9、12、15、22 g/L。可见L-丙氨酸产量与生物素添加量呈正相关。

4 在线膜偶联间歇透析发酵工艺

选取生物素添加量50 μg/L的发酵批次作为标准，每间隔4 h取样离心，测定发酵液中L-丙氨酸含量与L-缬氨酸含量，结果显示，在发酵前中期，菌体处于生产L-缬氨酸速率较高的阶段；发酵后期，L-缬氨酸产酸速率下降，L-丙氨酸产酸速率提升，因发酵液内L-缬氨酸产量过高而产生反馈抑制现象，菌体内代谢流量更多地流向L-丙氨酸方向，使得L-丙氨酸产量增多，降低了L-缬氨酸的转化效率。

如图8所示，采用在线膜偶联透析发酵工艺，在发酵进行至28 h时，罐内L-缬氨酸质量浓度累积至40 g/L，L-丙氨酸质量浓度累积超过了3g/L，主产物受到抑制，副产物进入快速生成阶段，此时对发酵液进行在线膜偶联透析，分离出发酵液内较高质量浓度的L-缬氨酸和L-丙氨酸，截留罐内菌体，使其在新加入的透析培养基中迅速恢复活力并继续发酵产酸；透析之后，罐内L-缬氨酸质量浓度降至3 g/L左右，L-丙氨酸质量浓度降至0.3 g/L左右，继续发酵24 h左右，罐内L-缬氨酸质量浓度再次达到40 g/L，且L-丙氨酸也再次累积至3 g/L，此时对发酵液进行第2次透析，降低罐内主副产物的含量，使发酵延续下去，延长菌体产酸周期，并大幅提高单批次发酵总产酸量。

如表2所示，透析前后发酵糖酸转化率由32%提高到34.5%，主产物产量增加，副产物产量降低，耗糖量也相应增加，罐内发酵液体积更接近初始装液量，稳定性增强。

讨论

本实验使用的菌株XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）在进行生物素不同梯度实验对比之后发现，增大生物素添加量后，菌体生物量的确有所增长，但是副产物L-丙氨酸含量增长更为明显，因此在利用谷氨酸棒杆菌XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）发酵生产L-缬氨酸时，造成L-缬氨酸产量下降的主要原因是丙酮酸节点流量过多地流向丙氨酸途径，从而减弱了L-缬氨酸途径，使产酸减少。

因此，如果能够从代谢改造的途径对菌种XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）的丙氨酸合成途径进行干扰或者削弱，丙酮酸节点流向L-缬氨酸的途径势必有所增加，从而进一步提高L-缬氨酸产量.采用在线膜偶联间歇透析发酵工艺能够直接有效地减少L-丙氨酸的生成，最终发酵液中L-丙氨酸质量浓度保持在3  g/L左右，相较之前的12 g/L降了75%左右，是行之有效的解决方式。

结论

生物素的外源添加对于菌体细胞自身的生长与产酸必不可少，本研究通过对生物素添加量进行梯度控制，确定了谷氨酸棒杆菌发酵生产L-缬氨酸过程中最适的生物素添加量。实验表明，当生物素添加量为50 μg/L时，经过52 h的发酵，L-缬氨酸产量达到72 g/L，糖酸转化率达到32%；在线膜偶联间歇透析发酵对于发酵液中主要产物的反馈抑制解除以及副产物的去除具有非常明显的效果，较透析之前，透析后的L-缬氨酸总产量提高了47.4%，转化率提高了2.5%，同时副产物L-丙氨酸产量下降了75%。目前，膜偶联间歇透析发酵还存在一些有待改进的方面，如果能够对微滤膜进行一些改进，解决上述问题，可进一步提高生产效益。