盐酸克伦特罗的检测方法

背景及概述^[1]

盐酸克伦特罗（clenbuteerol hydrochloride，CLB）是一种平喘药。盐酸克伦特罗能够促进动物的生长,控制肉畜体脂率，提高畜瘦肉比率。盐酸克伦特罗是一种肾上腺类神经兴奋剂，因其能促进脂肪分解、蛋白合成，又被称为 “瘦肉精”。CLB 结构中有多个可修饰位点，通过结合不同基团可以形成一系列类似物。CLB 极易被机体吸收，在动物组织中蓄积残留，且CLB 性质稳定，一般的烹饪方法不能使其分解。由此引发的中毒事件也不断发生，各国都采取了相应的法律法规监控在肉中的残留量。中国农业部的第 235 号公告修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》 规定CLB 在所有动物性食品中不得检出。

检测方法^[1]

由于 CLB 半衰期长，易蓄积在动物体内，其中大部分随尿液排出，少数残留在动物肝脏、肾脏、肌肉等部位。目前文献报道中常用固相萃取法处理肉样品，固相萃取技术具有操作简便、成本低、环保和可重复使用等优点，被广泛地应用于样品分离和浓缩过程中。此外，汤凯洁等用分子印迹聚合物（MIPs）富集猪肝中的 CLB 用于高效液相色谱检测。王宛等采用接枝中空纤维膜过滤去除样品中磷脂和蛋白质，用于液质联用的检测。

1 色谱法

1.1 高效液相色谱法（ HPLC）

HPLC 检测方法多集中在类（多）残留检测以及和其他检测技术联用方面。国标（ GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》 ）中HPLC 被杂，研究人员在此基础上进行改进，并未获取理想的效果。2015 年朱晓艾等分析比较了 4 种样品前处理的方法，并对色谱条件进行了优化，得到的线性范围为0.025 μg/mL～0.400 μg/mL，线性相关系数R2为0.999 6，回收率达 88.55 %～94.03 %。研究发现对肉样的前处理只需液液提取、蛋白质沉淀两个过程，快速简单，且出峰时间短。因此适用于样品数量较多时复检，以快速检测出阳性或疑似阳性的样品。

1.2 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）

GC-MS 是目前较成熟的一种联用技术，它把色谱的高效快速分离和质谱高灵敏的定性分析结合起来，因此具有分离效果好、 灵敏度高、 既可定性又可以定量等优点。由于 GC 适用于有较低沸点和较高热稳定性的样品，而 CLB 的极性大沸点高，故测定前要对CLB 衍生化。Yi Wen 等用 GC-MS 检测分析 CLB 残留之前，采用固相萃取/聚合物整体微萃取技术对猪肉样品进行处理，检出限为0.13μg/kg。GC-MS 可以准确地对某种特定的残留物进行定性、 定量分析，但是衍生化处理会造成实验偏差。

1.3 液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）

在检测复杂样品时，液相与质谱联用在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，液质联用技术已成为迅速的分析方法之一。而 HPLC-MS-MS 联用时信噪比可进一步提高。 陈海玲等建立了HPLC-MS同时测定猪尿中 CLB 和莱克多巴胺的方法，采用MCX 固相萃取柱萃取净化，并对质谱条件各参数进行优化，得到猪尿中克伦特罗和莱克多巴胺的检出限均为 1.0μg/kg。此方法适合生猪宰杀前快速、有效监测。色谱-质谱联用法能对 CLB 进行定性、定量测定，灵敏度较高，但此类方法需要对样品进行复杂的前处理（如采用气相色谱测定时，需要进行甲酯化衍生化反应），操作复杂，测试时间长、费用高，并且仪器昂贵、移动性差，难以推广普及。

2 免疫分析法

2.1 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫分析法（ELISA）基本原理是竞争性抗原抗体特异性反应。研究人员可根据抗体产生机理设计合成针对一类药物的单克隆或多克隆抗体，实现对同一类药物的高通量检测。目前已广泛应用于临床和食品安全检测。因 CLB 在国外应用较早，其 ELISA 检测方法的研究也比国内早。目前，欧盟、 美国在 CLB 的宰前尿检、 血检及屠宰现场检疫时都将其列为主要的筛选法。 许春光等用 Randox 公司产的 ELISA 检测试剂盒，结合 ELX800 通用酶标仪对 442 份生猪尿样进行检测，与 GC-MS 检测结果一致。 但无法满足 CLB 残留痕量、 超痕量检测的要求，所以 ELISA 一直作为大样本筛选的方法。

2.2 化学发光酶免疫分析法

1994 年 Rongen 等将化学发光标记应用于免疫分析，发现它的检测范围广、 发光反应快、孵育时间短、价格低廉等优点，可适用于各种类型的免疫分析。化学发光酶免疫分析是化学发光法和酶免疫法结合的产物，同时具有高灵敏性和高特异性，近年来得到广泛应用。 常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），而鲁米诺及其衍生物是最常用的酶促反应发光剂。用化学发光酶免疫法检测不同样品中 CLB 残留的相关文献报道如表 1 所示，对尿液采用间接夹心竞争免疫反应，对猪肉采用直接竞争免疫法，结果都能达到较低的检测限，且检测限差异不明显。

CLEIA 与 ELISA 不同之处在于酶标记反应体系是化学发光反应。化学发光的优点是线性范围宽、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、检测速度快、不受样本数量影响、试剂质量稳定。由于发光在瞬间完成，峰值出现的时间短，而且光背景高、成本相对较高。因此该法的应用受到一定的限制。

2.3 胶体金免疫技术

在碱性环境中，带负电荷的胶体金与带正电荷蛋白质分子基团通过吸附作用而形成牢固的结合，标记蛋白的生物活性并未受到影响。胶体金具有合成快速简单、 大小均一、 表面容易被硫基及其它生物基团修饰且生物相容性好等优点，近年来胶体金检测技术被广泛应用在食品安全监测中。2006 年，G.P.Zhang 等用金标单克隆抗体制成层析式试纸条检测残留在尿液中CLB，检测限能达到 1.0μg/mL，用特殊的模条扫描仪测定检测限可达 0.1μg/mL。传统的胶体金免疫层析方法主要是通过肉眼观察检测线的有无来判断检测结果，对待测物进行定性或者半定量检测，检测结果易受温度、光线等环境因素和检测者的主观因素影响。基于胶体金光学读取仪的胶体金免疫层析快速定量检测方法具有速度快、操作简便、灵敏度高、可定量检测、 数据可存储、 适合现场快速筛查等优点。

2.4 放射性免疫技术（RIA）

RIA 是一种新型检测技术，它是对微生物受体进行标记，结合化学发光技术、生物发光技术和 ELISA来进行检测的。RIA 检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点。目前国外已经开发出应用该技术的试剂盒，此外还建立了用受体代替抗体结合 CLB 的分析法，此方法检测限可达到 2.4 ng/g。但该方法所用的仪器昂贵，对试验条件要求严格，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，不属于目前主要的分析方法。

主要参考资料

[1]张瑞华,李芳,康怀彬,邹良亮,蔡超奇.动物源性产品中盐酸克伦特罗检测方法的研究进展[J].食品研究与开发,2017,38(03):208-211.