绿原酸的应用

背景及概述^[1][2]

绿原酸( chlorogenic acid)，又名咖啡鞣酸、咖啡单宁酸，化学名 3-O-咖啡酰奎尼酸，是由咖啡酸( caffeic acid) 与奎尼酸( quinic acid) 形成的缩酚酸。绿原酸是一种分布广泛且具有诸多药理活性的天然化合物，已被广泛应用于医药卫生及食品化工等行业。但目前我国在绿原酸的生物合成、药理活性以及开发利用等方面的研究仍较为滞后。我国具有丰富的富含绿原酸的植物资源，而目前绿原酸的主要来源是从天然植物中提取，如金银花、杜仲、咖啡豆以及向日葵等。

但是对于任何一种天然化合物，单纯依靠天然植物资源，均不利于可持续发展。因此，扩大其来源途径势在必行。目前已针对绿原酸的资源植物金银花开展了一系列的实验工作，包括金银花离体再生体系的建立、金银花悬浮细胞培养体系的建立、金银花绿原酸合成关键酶HQT 基因的克隆、表达以及功能鉴定、HQT 基因的过表达以及表达沉默研究等。这些研究的成功开展将为扩大绿原酸的来源途径、提高金银花的药材质量、科学合理的开发利用绿原酸以及为揭示绿原酸生物合成的分子机制提供理论和技术支持。

结构

分布^[1]

绿原酸在植物界的分布十分广泛，从双子叶植物到蕨类植物都有分布，主要存在于忍冬科忍冬属( Lonicera) 、菊科蒿属 ( Artemisia) 等植物中。在杜仲、金银花、咖啡、菊花等植物中的含量非常高。此外，马铃薯、胡萝卜、菠菜、苹果等蔬菜水果中也含有绿原酸。绿原酸的分布受产地、土壤质地、气候因子等外
部因素以及发育阶段、基因型、器官部位等内部因素的影响。就外部因素而言，在产地方面，研究发现不同产地野菊花以及山银花中绿原酸含量差异显著。

在土壤质地方面，研究均显示不同土壤质地对杜仲以及夏腊梅等植物中绿原酸含量具有一定的影响。就内部因素而言，不同的发育阶段对于元宝枫叶以及杭白菊中的绿原酸含量均产生一定的影响，采自 8 月份的元宝枫叶片中绿原酸含量最高，而花蕾期的杭白菊中绿原酸含量最高，胎菊期次之此外，植物的不同器官部位绿原酸的分布也有显著差异。综上，绿原酸的分布受诸多因素的影响，具有较复杂的生物学机制。对其分布进行深入的研究，对于科学合理的开发绿原酸资源具有重要的意义。

理化性质^[1]

绿原酸化学名为 3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式为C₁₆H₁₈O₉，分子量为 354. 30。其半水合物为白色或黄色针状结晶。在110 ℃ 时成为无水物，熔点206 ～ 208 ℃，比旋光度［α］ D = 35. 2°( C = 2. 8) 。在25 ℃ 时水中溶解度较低，约为 4%，在热水中溶解度会增大，且溶解度随温度而变化。易溶于乙醇、丙酮、甲醇; 微溶于乙酸乙酯; 难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。绿原酸为极性有机酸，不太稳定，在提取过程中易发生异构化。

绿原酸分子结构中含有的邻二酚羟基，是酚酶催化最适的反应底物，受热、见光易氧化，这也是许多含有绿原酸成分的水果如桃、苹果等褐变的关键原因，因此应在阴凉、避光条件下保存。在碱性条件下，绿原酸可发生水解，成为绿色醌类。植物体内存在的绿原酸往往是混合物而非单一组分，包括单咖啡酰奎尼酸、双咖啡酰奎尼酸、三咖啡酰奎尼酸、绿原酸甲酯。

生理活性及应用^[1]

1. 心血管保护作用

氧自由基是引起内皮损伤的重要因子之一，而大量的实验证明绿原酸是一种自由基清除剂及抗氧化剂 〔23，24〕，它通过清除氧自由基及抗脂质过氧化，可保护血管内皮细胞，进而对心血管系统产生有效的保护作用。研究发现绿原酸对心肌细胞能起到保护作用。 

2. 抗氧化作用

绿原酸分子中的活性羟基可以形成具有抗氧化作用的氢自由基，从而消除羟基自由基的活性，保护组织免受氧化作用的损伤。可能与绿原酸可以抑制 DNA 受到活性氧攻击时形成8-OH-dG 有关。

研究显示，绿原酸具有清除自由基的作用，且清除效果与其浓度呈剂量关系。其他的一些研究也证明，在绿茶、咖啡以及茵陈中提取的绿原酸均可以起到很好的抗氧化作用。

3. 抗紫外和抗辐射作用

研究发现以绿原酸为代表的天然多酚物质，可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害，有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害作用。目前已有多项添加绿原酸后用于皮肤防晒霜和洗发水的欧洲专利，这些产品对于抗辐射均具有一定的作用。

4. 抗诱变及抗癌作用

大量的实验均证明绿原酸具有抗诱变及抗癌的作用。如: 蔬菜、水果中的绿原酸可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素B1 和苯并［a］芘的变异原性; 绿原酸在碱性环境下能导致肿瘤细胞产生较大的 DNA 碎片，并引起核凝集; 绿原酸能抑制 4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO) 诱导的 8-羟基脱氧鸟苷( 8-OH-dG) 的增高，而后者是癌变和细胞氧化应激反应过程中的重要物质。绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。

5. 抗菌及抗病毒作用

在抗菌方面，目前的研究普遍认为绿原酸具有很好的抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、军团菌等细菌的作用，如别对金银花中的提取物绿原酸进行抗菌实验发现，绿原酸具有良好的抗金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的活性。

对烟草中的绿原酸进行抑菌试验也发现绿原酸除了具有抗金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的活性之外，对枯草芽孢杆菌也具有抑制作用。其抗菌机制可能与非竞争性抑制细菌体内的芳基胺乙酰转移酶有关。在抗病毒方面，研究发现从返魂草提取物中获得的绿原酸对流感病毒、呼吸合胞病毒及腺病毒均具有抑制作用。

6. 降脂作用

研究表明口服绿原酸有降低大鼠内脏脂肪堆积和体脂量的趋势。绿原酸 5mg /mL 静脉给药，连续 3 周，可使大鼠血浆中胆固醇以及甘油三酯分别下降 44%。研究发现金银花提取物能降低血清和肝组织均有所下降。

7. 抗白血病作用

就绿原酸对白血病细胞的抑制作用进行了研究，发现-20 ℃ 避光保存的氯原酸钠可以选择性抑制 bcr-abl 阳性的白血病细胞系 K562 细胞的增殖。而4 ℃ 保存的氯原酸钠对 bcr-abl 阳性的白血病细胞系 K562 的增殖抑制作用增强，并且对 bcr-abl 阴性的 Jurkat 细胞亦具有增殖抑制作用。在其对大血藤中酚类化合物进行抗肿瘤活性筛选时发现绿原酸对人慢性髓白血病 K562 细胞具有抑制作用。

8. 免疫调节作用

研究发现绿原酸对上皮内淋巴细胞( IEL) 上清液以及肠道固有层淋巴细胞( LPL) 上清液中 NF-γ 和 TNF-α 水平影响均较大。体外研究显示绿原酸可显著增强流感病毒抗原引起的 T 细胞增殖，并且能诱导人淋巴细胞及人外周血白细胞生成 IFN-γ 和 IFN-α。

此外，绿原酸亦能提高大鼠体内的 IgE、IgG1 和 IL- 4 的水平。绿原酸能够增强巨噬细胞的功能。因此，绿原酸具有一定的免疫调节能力。

9. 降血糖作用

对绿原酸的降血糖药效学进行了研究，发现绿原酸粗提物可有效降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖，且给药后高、中、低剂量组间血糖值无显著性差异，说明该药物无剂量依赖性。但其对正常小鼠的血糖无明显影响。金银花提取物可降低蔗糖性高血糖小鼠和四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖。

此外，研究也显示，3 h内绿原酸的降糖效应与格列本脲无统计学差异。其机制可能与抑制葡萄糖- 6-磷酸位移酶和葡萄糖吸收有关。

10. 其它

除以上诸多的药理活性之外，绿原酸还具有抗炎活性，据报道，绿原酸类物质可以通过抑制透明质酸酶 ( HAase) 的活性而起到消炎的作用。此外，绿原酸尚具有保肝利胆、解痉之功效。

含量测定^[3]

HPLC法

(1) 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 乙腈-0.4%磷酸溶液 (13：87) 为流动相; 检测波长为327nm。理论板数按绿原酸色谱峰计大于1000。

(2) 对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40μg的溶液，即得 (10℃以下保存)。

(3) 样品溶液的制备 取样品干燥粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，称重，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

(4) 测定 分别精密吸取对照品与样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

(5) 色谱图

C.绿原酸

(6) 测定结果 通过十多批样品测定，确定金银花中绿原酸的含量不少于1.5%。

制备^[1]

目前公认的绿原酸可能合成途径有三条，如图所示：

其中途径 1 可能是作为在 HQT活性较低的细胞器内合成绿原酸的途径。关于途径 2，由于在拟南芥细胞中 HCT和 C3' H (p-coumarate 3'-hydroxlase) 活性都很高的情况下，并未有发现绿原酸，说明途径 2 可能不是植物大量合成绿原酸的主要途径。目前大量的证据均支持途径 3，即通过 HQT合成绿原酸的途径可能是其主要的合成途径。

主要参考资料

[1] 邓良, 袁华, & 喻宗沅. (2005). 绿原酸的研究进展. 化学与生物工程, 22(7), 4-6.

[2] 吴卫华, 康桢, 欧阳冬生, & 周宏灏. (2006). 绿原酸的药理学研究进展. 天然产物研究与开发, 18(4), 691-694.

[3]天然药物成分定量分析