柚木柯因对前列腺癌细胞凋亡的影响及其机制研究

柚木柯因(tectochrysin)为黄酮类化合物，它广泛存在于水果和蔬菜中,具有抗炎、抗氧化、抗心脑血管疾病等作用。已有研究表明,柚木柯因除了可通过使 STAT3失活而抑制非小细胞型肺癌细胞生长的作用外,尚可通过抑制NF-kB通路、增强死亡受体表达等途径而具有抗结肠癌的作用。因此本文将不同剂量的柚木柯因作用于前列腺癌细胞22Rv.1,观察其作用效果,以期发现治疗前列腺癌的新药并揭示其可能的作用机制[1]。

实验方法

细胞增殖实验：取完全培养液稀释后的RWPE-1和22Rv.1细胞于96孔板中以每孔100pl的接种量接种,在37℃5%CO₂的细胞培养箱中培养约3h。待细胞完全贴壁后,加入柚木柯因,使其终浓度分别为0、2.5、5、10和20μg/ml,设3复孔,将细胞在37°C5%CO₂的细胞培养箱中分别培养0h、24h、48h和72h。待药物作用结束后,于每孔加入10μlCCK8溶液,震荡混匀后于细胞孵箱中继续孵育3h,然后用酶标仪于490nm波长下检测吸光度(OD值)。

流式细胞仪检测RWPE-1以及22Rv.1细胞凋亡和细胞周期：将完全培养液处理后的RWPE-1和22Rv.1细胞以2ml/well的剂量接种到6孔板中,并将细胞放置于37℃5%CO₂，条件的细胞培养箱下进行培养。待细胞长至80%融合时,弃培养液,设三复孔,分别加入含有0、2.5、5、10 和20μg/ml浓度柚木柯因的RPMI 1640完全培养液后,将细胞继续置于细胞培养箱中培养24h,将细胞用细胞凋亡(FITCPE)和细胞周期(PI)染色试剂盒染色后,最后通过流式细胞仪检测细胞凋亡和死亡的百分比以及细胞周期分布的改变,试剂用量和染色方法按试剂说明书进行。

Hoechst 33342染色法检测RWPE-1和22Rv.1细胞核型变化：将完全培养液培养稀释好的RWPE-1和22Rv.1细胞以2ml/well的剂量分别接种于6孔培养板，并将细胞放置于37℃5%CO₂，条件的细胞培养箱下进行培养。待细胞长至80%融合时,弃培养液，设三复孔,分别加入含有0、10和20μg/ml浓度柚木柯因的RPMI 1640完全培养液后,将细胞继续置于细胞培养箱中,培养24h后取出细胞,将细胞进行hoechst 33342染色后(试剂用量和染色方法按说明书进行),最后在荧光倒置显微镜下观察细胞核型变化。

LDH释放实验检测柚木柯因对22Rv.1细胞的细胞毒作用：分别用0。2.5、5、10和20μg/ml浓度的柚木柯因于37℃5%CO₂，条件下作用细胞融合度为80%的22Rv.1细胞,待作用24h后,收集细胞和培养上清,用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒测定LDH水平,试剂用量和实验方法按试剂盒的说明书进行。并通过计算LDH释放率(%)=培养液中LDH含量/(培养液中LDH含量+细胞裂解液中LDH含量)x100%，以分析柚木柯因对22Rv.1细胞的细胞毒作用。

结果

柚木柯因对RWPE-1和22Rv.1细胞增殖活性的影响：柚木柯因(0、2.5、5、10和20μg/ml)分别作用前列腺癌细胞22Rv.1和前列腺正常细胞RWPE-10h、24 h、48h和72h。结果如下表所示,2.5~10μg/ml柚木柯因对22Rv.1细胞的增长较正常前列腺细胞RWPE-1有显著的抑制作用(P<0.01,n=3),并且作用效果随着用药剂量和用药时间的增加而增强,但当用药剂量达到20μg/ml时,柚木柯因在明显抑制22Rv.1细胞增殖的同时也明显抑制正常前列腺细胞RWPE-1的增殖,因此,在2.5~10μg/ml剂量范围内,柚木柯因可安全有效的用于前列腺癌的治疗。

柚木柯因对RWPE-1和22Rv.1细胞的细胞凋亡和死亡的影响：分别用0、2.5、5、10 和20μg/ml浓度的柚木柯因作用RWPE-1和22Rv.1细胞24h。流式细胞仪检测结果如下表所示,柚木柯因诱导了前列腺癌细胞22Rv.1凋亡和死亡,且作用效果随着用药剂量的增加而增加。同时实验结果也证实,柚木柯因用药剂量在2.5~10μg/ml范围内,对正常前列腺细胞死亡和凋亡率的影响远小于对前列腺癌细胞22Rv.1的影响。

综上表明,柚木柯因可以通过影响PI3K/AKT和TRAIL信号通路诱导前列腺癌细胞22Rv.1凋亡,并且这两种信号通路的作用相互联系,相互促进。本文同时证实了柚木柯因在2.5~10μg/ml剂量下对正常前列腺细胞RWPE-1的影响不大,故使得杨芽黄素可作为一种高效低毒的化疗药物安全有效地应用于抗前列腺癌的治疗[1]。

参考文献

[1]王瑜,柯瑞君,蒋盼若,等. 杨芽黄素对前列腺癌细胞凋亡的影响及其机制[J]. 中国应用生理学杂志,2019,35(3):283-288. DOI:10.12047/j.cjap.5754.2019.059.