BRADFORD法蛋白定量试剂盒的应用

背景^[1-3]

BRADFORD法蛋白定量试剂盒是根据最常用的两种蛋白浓度检测方法之一Bradford法研制而成，实现了蛋白浓度测定的快速、稳定和高灵敏度，并且检测数据有很好的线性关系。

Bradford法的检测原理是考马斯亮蓝(Coommassie Brilliant Blue)G-250与蛋白质的碱性和芳香族氨基酸特别是精氨酸(Arginine)在酸性介质中结合后，溶液转变为蓝色，溶液吸收峰从465nm迁移到595nm，颜色的变化与蛋白质浓度成正比。因此，可通过检测595nm处的吸光度对溶液中蛋白质浓度进行测定。

BRADFORD法蛋白定量试剂盒

与测定蛋白浓度的其它方法如BCA法和Lowry相比，Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，尤其是还原试剂的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M，DTT的浓度可高达5mM。

操作说明：

1. 完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul，使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

2. 5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml 5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

3. 将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。

4. 将样品作适当稀释（多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。

5. 各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。

6. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。

7.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

应用^[4][5]

用于应用定量蛋白质组学方法研究代谢综合征早期肾损害尿液蛋白标志物研究

在尿液蛋白质组学研究中,建立一种应用硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜快速富集和储存大量尿蛋白的样品处理方法。

方法：（1）收集健康男性和女性志愿者各2人晨起次尿液250mL,取等量尿液混合,平均分为20mL每管,—80℃冻存待用。

（2）取20mL尿液,按尿液与丙酮体积比1：3在4℃下沉淀过夜富集尿蛋白,重复3次。

（3）取20mL尿液,冰浴中将尿液按20mL/min循环通过NC膜1分钟（尿液一次通过NC膜的时间）、10分钟、30分钟、1小时、2小时和15小时,每个时间段重复3次。

（4）取尿液20mL,按步骤（3）方法通过NC膜0分钟,将吸附有蛋白的NC膜置一80℃冻存6个月,重复3次。

（5）Bradford法测量尿蛋白浓度,应用t检验的方法比较丙酮沉淀富集和NC膜各时间段吸附的尿蛋白含量。

（6）应用SDS—PAGE初步比较丙酮沉淀富集和NC膜吸附的尿蛋白。（7）应用液相色谱分离串联质谱（LC-MS/MS）鉴定丙酮沉淀富集、NC膜吸附和冻存的尿蛋白。

结果：1、NC膜能够快速吸附尿蛋白,lmin-2h时蛋白量无显著差异（P>0.05）,15小时时吸附的尿蛋白量最多（P<0.05）。丙酮沉淀法富集的蛋白量较NC膜吸附lmin-2h多（P<0.05）,较NC膜吸附15小时无显著差异（P=0.953）。

2、SDS-PAGE结果显示,与丙酮沉淀法相比,NC膜吸附法包含了丙酮沉淀的主要蛋白条带,但明显减少了白蛋白的富集。

3、LC-MS/MS鉴定结果显示,丙酮沉淀法、NC膜吸附0分钟和NC膜吸附15小时三组分别鉴定到628、619和323个蛋白,三组质谱鉴定的重复率分别为82.7%、76.7%和60.5%。

参考文献

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[2]Discovery of novel bladder cancer biomarkers by comparative urine proteomics using iTRAQ technology.[J].Chen Yi-Ting,Chen Chien-Lun,Chen Hsiao-Wei,Chung Ting,Wu Chih-Ching,Chen Chi-De,Hsu Chia-Wei,Chen Meng-Chieh,Tsui Ke-Hung,Chang Phei-Lang,Chang Yu-Sun,Yu Jau-Song.Journal of proteome research.2010(11)

[3]Optimizing a proteomics platform for urine biomarker discovery.[J].Afkarian Maryam,Bhasin Manoj,Dillon Simon T,Guerrero Manuel C,Nelson Robert G,Knowler William C,Thadhani Ravi,Libermann Towia A.Molecular&cellular proteomics:MCP.2010(10)

[4]Proteomics technologies for the global identification and quantification of proteins[J].Ian A.Brewis,P.Brennan.Advances in Protein Chemistry and Structural Biology.2010

[5]刘雪姣.应用定量蛋白质组学方法研究代谢综合征早期肾损害尿液蛋白标志物[D].北京协和医学院,2012.