游离生物素测定培养基的应用

背景^[1-3]

游离生物素测定培养基用于婴儿食品和乳粉中游离生物素测定。

生物素又名维生素h、辅酶r等。生物素是一个脲基环含有一个硫原子和一条戊酸的侧链，现已知有8种异构体，天然存在的仅α-生物素，并且有生物活性。生物素为无色的针状结晶，极易溶于水，微溶于冷水，能溶于乙醇，但不溶于有机溶剂。对热稳定，一般烹调损失不大，强酸、强碱和氧化剂可使其破坏，紫外线也可使其逐渐破坏。体内生物素主要储存在肝脏，血液中含量较低。

食物的生物素主要以游离形式或与蛋白质结合的形式存在。与蛋白质结合的生物素在肠道蛋白酶的作用下，形成生物胞素，再经肠道生物素酶的作用，释放出游离生物素。生物素吸收的主要部位是小肠的近端。低浓度时，被载体转运主动吸收；浓度高时。则以简单扩散形式吸收。吸收的生物素经门脉循环，运送到肝、肾内贮存，其他细胞内也含有生物素，但量较少。人体的肠道细菌可从二庚二酸取代壬酸合成生物素，但作为人本生物素直接来源是不够的。人体内生物素主要经尿排出，乳中也有生物素排出，但量很少。

游离生物素测定培养基

用法：称取本品7.5克，加热溶解于100ml高纯双蒸馏水中，分装试管中，每管5ml，加入标准或测试样品，用高纯双蒸馏水调整体积至10ml，121℃高压灭菌5分钟，备用。

应用^[4][5]

用于谷氨酸生产菌种选育和高产条件的优化及生物素的测定研究

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）W3为出发菌株,经过紫外线、亚硝酸钠理化复合诱变筛选了谷氨酸营养缺陷型回复突变株W3-2-77,该菌株与出发菌株相比,谷氨酸产量有所提高。之后,以此菌株为出发菌株,经过连续的紫外诱变,最终得到了天冬氨酸渗漏性、谷氨酰胺抗性突变株W3-4-12,该菌株解除了代谢途径中的反馈调节作用,使谷氨酸产量达到78g/L,较出发菌株提高了21%。

通过菌株传代试验,最终验证高产菌株遗传性状稳定。菌株W3-4-12发酵条件的优化显示,种子培养基中尿素的添加量对发酵的影响较大,当尿素含量为0.6%、种龄11h、一级接种量7%、装液量25mL/250mL时能得到产酸量。

对于发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐离子的选择和添加比例,本文通过多轮发酵比较产量的方式,分析确定了培养基中的原料,并对培养基各因素进行了单因素实验,确定其添加量。

之后,选取影响较为显著的四因素以L9（34）正交试验进行分析,最终得到葡萄糖、尿素、KCl、Na2HPO4的添加量。另外,本文提出了在不同温度及pH条件下分阶段发酵产酸的具体条件,并且引入了分瓶培养的思想,将发酵过程分为“生长期”与“生产期”两个阶段以提高菌体产酸。

前期30 mL/500 mL发酵15 h后分瓶15 mL/500 mL发酵至38 h结束,产酸112 g/L,糖酸转化率62%,与优化前相比,谷氨酸产量提高了44%。本文还利用二次接种与补料分批发酵相结合的方法,进一步提高了谷氨酸的产量。

在二次接种的方法中,除了确定了接种量及种龄等条件外,还采用了二级种子液扩培的方式,增大了菌浓,克服了分瓶发酵产酸周期较长的缺点,缩短发酵周期至3436 h。最终结合补料分批发酵的培养技术,得到一整套较为完整的发酵工艺,最高产酸117 g/L。

在发酵结束后,本文测定了发酵前培养基、最终发酵液以及原料中生物素的含量,建立了荧光法检测谷氨酸发酵中生物素含量的方法,该方法的稳定性较好。

参考文献

[1]Screening,mutagenesis and protoplast fusion of Aspergillus niger for the enhancement of extracellular glucose oxidase production[J].A.A.Khattab,W.A.Bazaraa.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2005(7)

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[3]Regulation of acetate metabolism in Corynebacterium glutamicum:transcriptional control of the isocitrate lyase and malate synthase genes[J].Volker F.Wendisch,Marion Spies,D.J.Reinscheid,Stephanie Schnicke,Hermann Sahm,B.J.Eikmanns.Archives of Microbiology.1997(4)

[4]Urease activity in a glutamate producing Brevibacterium sp.[J].K.Madhavan Nampoothiri,Ashok Pandey.Process Biochemistry.1996(5)

[5]王欣.谷氨酸生产菌种选育和高产条件的优化及生物素的测定[D].山东轻工业学院,2011.