多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基的应用

背景^[1-3]

多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基用于产气荚膜梭菌糖（醇）发酵的基础培养基。成分(g/L)；多价胨20.0；酵母膏5.0；氯化钠5.0；pH值6.9±0.1；25℃。

用法：称取本品30.0g,并加入10g糖或醇,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装到螺帽试管内,每管9ml,121℃高压灭菌15分钟,备用。

原理：多价胨、酵母膏提供细菌生长所需的营养素，氯化钠维持均衡的渗透压。

多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基

产气荚膜梭菌曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。

产气荚膜梭菌为革兰阳菌粗短大杆菌，大小（1~1.5）μm×（3~5）μm。两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞。在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。

产气荚膜梭菌所有型菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，产酸产气。不发酵甘露醇或水杨苷；液化明胶，产生H2S，不能消化已凝固的蛋白质和血清，吲哚阴性。主要代谢产物为乙酸和丁酸，有时也形成丁醇。

应用^[4][5]

用于产气荚膜梭菌Beta2毒素的细胞毒性与致病机理研究

利用基因重组技术获得纯化的重组Beta2毒素蛋白（rCPB2）,制备和筛选获得针对该蛋白的单克隆抗体,并对Beta2重组毒素作用靶细胞的过程进行示踪研究;

通过分析纯化Beta2重组毒素作用靶细胞后的细胞凋亡率、ROS和NO的积累量、线位体膜损伤情况,以及BCL-2蛋白家族及Caspase蛋白家族等细胞凋亡信号通路中蛋白分子的表达变化,探讨了Beta2毒素的细胞毒性,揭示其诱导宿主细胞损伤的可能分子机制。

最后利用纯化的CPB2重组毒素蛋白对小鼠以尾静脉注射和灌胃两种途径分别作用于成年小鼠和乳鼠体内,检测分析了小鼠血清、小肠组织和脾脏中的Th1/Th2/Th17细胞亚群分泌的炎性细胞因子的变化。

综合评价分析以上rCPB2的细胞毒性及可能诱发机体的炎性损伤机制,揭示了Beta2毒素对宿主细胞的损伤机理,阐明产气荚膜梭菌感染引发动物肠炎的可能致病机制,为进一步开展产气荚膜梭菌的致病机理研究和制订免疫预防策略提供理论依据。

主要取得了以下研究结果:1、利用基因重组技术构建并筛选获得BL21（pTIG-cpb2）重组大肠杆菌,实现了Beta2重组毒素的大量表达,并利用AKTA纯化系统的金属离子亲和层析法获得纯化的重组Beta2毒素（rCPB2）;经去除内毒素后,以人正常结肠黏膜上皮细胞（NCM460）为靶细胞,使用噻唑蓝比色检测技术对纯化Beta2重组毒素的毒性进行了初步检测;结果表明,重组Beta2毒素具有与天然毒素相似的生物学毒性,其ID50为15μg/mL。

2、通过杂交瘤细胞融合技术建立并筛选获得三株针对产气荚膜梭菌Beta2毒素的杂交瘤细胞系,McAb 1E23,2G7和2H7;经检测确定三种单克隆抗体（McAb）均能通过免疫印迹、ELISA、免疫荧光染色实验和毒素中和实验识别重组的rCPB2。在所有测试中,McAb 1E23在这三种McAb中显示出对rCPB2毒素蛋白和天然CPB2毒素蛋白最宽泛和最特异性的免疫学反应,而且其对rCPB2的免疫荧光分析染色还示踪证实了rCPB2首先通过与细胞膜结合,然后跨膜转移至细胞质的动态变化过程;这些抗体将为研究CPB2的细胞毒性与致病机制、毒素的检测提供可靠的工具,甚至可能在临床治疗时中和CPB2毒素发挥作用。

参考文献

[1]Binding and entry of Clostridium difficile toxin B is mediated by multiple domains[J].Jared S.Manse,Michael R.Baldwin.FEBS Letters.2015

[2]Intravascular Hemolysis and Septicemia due to Clostridium perfringens Emphysematous Cholecystitis and Hepatic Abscesses[J].Justin Cochrane,Lacie Bland,Mary Noble,Bruno Megarbane.Case Reports in Medicine.2015

[3]Pyknotic cell death induced by C lostridium difficile TcdB:chromatin condensation and nuclear blister are induced independently of the glucosyltransferase activity[J].Katharina Wohlan,Sebastian Goy,Alexandra Olling,Sangar Srivaratharajan,Helma Tatge,Harald Genth,Ralf Gerhard.Cell Microbiol.2014(11)

[4]Mechanisms of Increased In Vivo Insulin Sensitivity by Dietary Methionine Restriction in Mice[J].Stone,Kirsten P,Wanders,Desiree,Orgeron,Manda,Cortez,Cory C,Gettys,Thomas W.Diabetes.2014(11)

[5]曾瑾.产气荚膜梭菌Beta2毒素的细胞毒性与致病机理研究[D].宁夏大学,2017.