蛋白定量试剂盒的应用

背景^[1-3]

蛋白定量试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一。

蛋白定量的主要原理是：蛋白质在碱性条件下，可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA（Bicinchoninic acid）试剂结合，最终生成紫色的复合物。该复合物在562 nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。

蛋白定量试剂盒

使用方法

1.BCA工作液的配制

（1）BCA工作液总体积的计算：

BCA工作液总体积=（标准品数量+待测样品数量+1）×重复数×200μL。

（2）BCA工作液的配制：按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

2.BSA标准品的配制

将BSA标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

3.取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，

4.往每孔中加入200μL的BCA工作液，盖上96孔板盖子。

5.将96孔板放37℃，30分钟。

6.用酶标仪测562 nm处的光吸收值。

7.根据BSA标准品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即为最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

应用^[4][5]

用于妊娠期高血压疾病患者血清、胎盘组织中VEGF、vWF的表达及其与24小时尿蛋白定量的相关性研究

对于妊娠期高血压疾病的诊断和分类标准所确诊的77例妊娠期高血压患者（妊娠期高血压24例,轻度子痫前期26例,重度子痫前期27例），正常对照组31例（正常妊娠晚孕组），两组孕妇年龄、孕龄及孕次、分娩方式之间无显著性差异。

各组孕妇血清中VEGF及vWF的表达，通过ELISA方法，经全自动酶免仪测定；胎盘组织中VEGF及vWF的表达通过SP免疫组化法检测；子痫前期患者24小时尿蛋白定量，通过免疫比浊法在全自动生化分析仪上检测。将所得数据输入SPSS19.0软件进行分析，各组均值以平均值±标准差（x±s）表述；结合图像分析技术对免疫组化检测结果进行统计学分析。

结果：①与正常对照组比较，妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期三组患者血清和胎盘组织中VEGF含量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；轻度子痫前期组患者其含量最低，重度子痫前期组患者血清和胎盘组织中VEGF含量均高于轻度子痫前期组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；子痫前期患者血清与胎盘组织中VEGF的表达呈正相关（r=0.309，P＜0.05）。

②妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期三组患者血清和胎盘组织中vWF的表达逐渐增高，各组间差异有统计学意义（P＜0.05）；妊娠期高血压组与对照组孕妇比较，血清和胎盘组织中vWF的表达均有增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；轻、重度子痫前期患者血清和胎盘组织中vWF的表达均显著高于正常对照组（P＜0.05），且随病情加重呈递增趋势；子痫前期患者血清与胎盘组织中vWF的表达呈正相关（r=0.562，P＜0.01）。

③子痫前期患者血清中vWF的表达与24小时尿蛋白定量呈显著正相关，且二者之间有直线回归关系（r=0.748，R2=0.56,F=31.722,P＜0.01）。

参考文献

[1]The Two Stage Model of Preeclampsia:Variations on the Theme[J].J.M.Roberts,C.A.Hubel.Placenta.2009

[2]Endothelial dysfunction and raised plasma concentrations of asymmetric dimethylarginine in pregnant women who subsequently develop pre-eclampsia[J].The Lancet.2003(9368)

[3]Hypoxia-induced angiogenesis of cultured human salivary gland carcinoma cells enhances vascular endothelial growth factor production and basic fibroblast growth factor release[J].H.Ishibashi,T.Shiratuchi,K.Nakagawa,M.Onimaru,T.Sugiura,K.Sueishi,K.Shirasuna.Oral Oncology.2001(1)

[4]Hypoxia and VEGF mRNA Expression in Human Tumors[J].Lisa S.Ziemer,Cameron J.Koch,Amit Maity,Deirdre P.Magarelli,Anna Marie Horan,Sydney M.Evans.Neoplasia.2001(6)

[5]苏叶青.妊娠期高血压疾病患者血清、胎盘组织中VEGF、vWF的表达及其与24小时尿蛋白定量的相关性研究[D].延安大学,2013.