血液基因组DNA小量提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

血液基因组DNA小量提取试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA,然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

此试剂盒设计用于从高达200uL的全血中快速制备DNA。DNA可以从包括人在内的各种物种的血液中分离出来。单个样品的制备时间少于30分钟，每个试剂盒包含足够的材料用于50次制备。该试剂盒从血液样本中分离基因组DNA，线粒体DNA，病毒DNA和细菌DNA。纯化的DNA具有优异的质量和产量，并且与下游应用完全兼容，包括PCR，qPCR，测序，基因分型，病毒检测，Southern印迹分析。

血液基因组DNA胶图

操作步骤：

1、样品处理：

1.1、提取200 ul血液样品时，向离心管(自备)中加入样本后，可直接进行下一步实验。

1.2、当血液样本量小于200μl时，加入Buffer GR补足至200μl，再进行下一步实验。

2、向以上溶液中加入20μl蛋白酶K，混匀。

3、加入200μl Buffer GL，震荡至彻底混匀。

4、56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。

5、加入200μl无水乙醇，颠倒混匀数次。短暂离心，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。

6、将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

10、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

应用^[4][5]

用于慢性氟中毒患者及大鼠血液与肝组织DNA修复基因甲基化改变的研究

通过研究地氟病患者以及氟中毒大鼠模型DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因（MGMT）、错配修复基因（MLH1）启动子区甲基化水平检测其mRNA及蛋白水平改变，探讨DNA修复基因甲基化、基因表达与地方性氟中毒发生发展的关系。

方法：1.在典型燃煤型地氟病区进行抽样，选取45名村民为氟病组，根据患者氟斑牙和氟骨症的分度分组，依次分为轻度组、中度组和重度组，在非氟病区贵阳市沙文镇新寨村，选取年龄性别平衡均匹配的健康人群做为正常对照。

酚氯仿法抽提全血DNA，甲基化特异性PCR（MSP）法检测DNA中MGMT、MLH1基因甲基化水平。提取受检者血液RNA，实时荧光定量PCR法检测MGMT、MLH1基因mRNA表达水平变化。

2. 复制慢性氟中毒大鼠模型，20只/组，分为对照组和染氟组，对照组常规饲养，染氟组大鼠的饮用水中加入氟化钠50mg/L，饲养6个月之后采取股动脉放血方式处死。取其动脉血及肝组织，酚氯仿法抽提基因组DNA，MSP法检测血液样本及肝组织中MGMT、MLH1基因甲基化水平。

提取总RNA，实时荧光定量PCR法检测各组MGMT、MLH1基因mRNA表达水平；裂解法提取肝组织蛋白，采用Western blot检测各组MGMT、MLH1蛋白表达水平。

结果（1）氟病区患者血液样本MGMT、MLH1基因明显出现甲基化，且甲基化阳性率随氟中毒程度加深而升高，差异有统计学意义（P<0.05）；

（2）氟病区患者血液样本MGMT、MLH1基因mRNA表达水平较对照组相比降低，且表达水平与氟中毒程度成负相关，差异有统计学意义（P<0.05）。

参考文献

[1]Environmental Toxicants—Induced Epigenetic Alterations and Their Reversers[J].MINJU KIM,MINJI BAE,HYUNKYUNG NA,MIHI YANG.Journal of Environmental Science and Health,Part C.2012(4)

[2]The pollution control of fluorine and arsenic in roasted corn in“coal-burning”fluorosis area Yunnan,China[J].Ling Li,Kun-li Luo,Yong-lin Liu,Yong-xin Xu.Journal of Hazardous Materials.2012

[3]Effects of fluorides on apoptosis and activation of human umbilical vein endothelial cells[J].MSzczepański,MKamianowska,GKamianowski.Oral Diseases.2012(3)

[4]Sodium fluoride induces apoptosis and alters bcl-2 family protein expression in MC3T3-E1 osteoblastic cells[J].Shiyong Yang,Zhi Wang,Colin Farquharson,Rashad Alkasir,Mohammad Zahra,Gaixian Ren,Bo Han.Biochemical and Biophysical Research Communications.2011(4)

[5]王煜蘅.慢性氟中毒患者及大鼠血液与肝组织DNA修复基因甲基化改变的研究[D].贵阳医学院,2014.