人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中ICOS的含量。

实验原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的IDS呈正相关。

人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于羊水培养细胞溶酶体酶活性测定方法和正常参考值范围的建立研究

建立本实验室产前筛查溶酶体酶活性的检测方法和参考值范围,以探讨酶活性检测产前诊断中的应用,提高特发性NIHF的病因诊断率。

方法：纳入了无不良妊娠史及家族史、胎儿超声无明显异常且经羊水染色体检查结果正常的羊水,共68例。孕妇行羊水穿刺的适应症包括高龄和染色体非整倍体高风险,羊水穿刺在妊娠第16至22周之间进行。所有羊水经细胞培养进行扩增,在21至28天用细胞刮刀收获,并于-80℃冻存。

检测羊水细胞酶活性时将其迅速解冻,以双蒸水裂解细胞膜,并通过超声粉碎仪制成细胞匀浆。细胞匀浆的蛋白质浓度用BCA蛋白试剂盒测定。采人工合成荧光底物测定人羊水细胞中L-α-艾杜糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性,用比色法测定芳基硫酸酯酶A的活性。

采用Q-Q图和散点图的方法检验数据是否符合正态分布,结果以平均值±标准差（x±s）表示,计算酶活性的95%置信区间。结果建立了本实验室检测羊水细胞中L-α-艾杜糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶和芳基硫酸酯酶A活性的方法,未能检测出β-半乳糖苷酶的活性。

羊水细胞中五种溶酶体酶活性的参考范围:L-α-艾杜糖苷酶61.95±4.93（52.00～71.91）nmol/mg·pro/h N=41半乳糖-6-硫酸酯酶114.63±17.53（97.10～132.16）nmol/mg·pro/17h N=43β-葡萄糖醛酸酶66.86±4.47（57.92～75.79）nmol/mg·pro/h N=62β-葡萄糖苷酶95.94±8.23（79.45～112.44）nmol/mg·pro/h N=56芳基硫酸酯酶A 570.04±59.18（449.17～690.90）nmol/mg·pro/17h N=31。

结论建立了人羊水细胞中L-α-艾杜糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶和芳基硫酸酯酶A五种溶酶体酶的检测方法和正常活性参考范围,为NIHF的产前诊断和病因学分析提供了新的筛查方法。

溶酶体酶的活性在一般人群中变异较大,酶活性低于参考值下限不足以诊断溶酶体贮积症,但可以作为一种排除手段,应用于NIHF的病因学分析。有必要时应检测羊水中的糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAGs）的浓度和进一步行分子遗传学诊断。

参考文献

[1]Prevalence of glucocerebrosidase mutations in the Israeli Ashkenazi Jewish population.Horowitz M,Pasmanik-Chor M,Borochowitz Z,Falik-Zaccai T,Heldmann K,Carmi R,Parvari R,Beit-Or H,Goldman B,Peleg L,Levy-Lahad E,Renbaum P,Legum S,Shomrat R,Yeger H,Benbenisti D,Navon R,Dror V,Shohat M,Magal N,Navot N,Eyal N.Human Mutation.1998

[2]Common and uncommon pathogenic cascades in lysosomal storage diseases.Vitner,Einat B,Platt,Frances M,Futerman,Anthony H.Journal of Biological Chemistry.2010

[3]An improved determination of total glycosaminoglycans in body fluids by formation of complexes with quinacrine:Changes in amniotic fluid total glycosaminoglycans during normal pregnancies and in pregnancies at risk for mucopolysaccharidoses.Sunil Kumar Mitra,Karl Blau.Clinica Chimica Acta.1978

[4]Lysosomal diseases:Overview on current diagnosis and treatment.F.d.O.Poswar,F.Vairo,M.Burin,K.Michelin-Tirelli,R.G.Genetics,M.Biology.2019

[5]刘星.羊水培养细胞溶酶体酶活性测定方法和正常参考值范围的建立[D].山东大学,2020.