DH5Α感受态细胞的应用

背景^[1-3]

DH5Α感受态细胞是一种可以用于常规质粒高效转化的质粒克隆化学感受态细胞，是实验室最为常用的大肠杆菌菌株之一。它广泛用于基因克隆、蓝白筛选、质粒稳定扩增等分子生物学实验。

DH5Α感受态细胞的遗传特性使其对外源DNA的摄取和质粒的稳定保持具有高效性。这种细胞经过特殊处理，如电击法或CaCl2法等，使得细胞膜的通透性发生暂时性的改变，从而允许外源DNA分子进入，即成为感受态细胞。

DH5α菌株具有一些特殊的遗传特点，如缺失核酸内切酶（endA），这有助于提高质粒DNA的产量和质量；同时，它是重组酶缺陷型（recA），这减少了插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性。此外，lacZΔM15是表达β-半乳糖苷酶α片段的一段基因，当M15缺失时，虽然lacZ基因能表达ω片段，但不能表达α片段，这使得β-半乳糖苷酶没有活性。因此，DH5Α感受态细胞可以用于蓝白斑筛选。

使用pUC19质粒进行热激活转化时，DH5Α感受态细胞的转化效率可以高达1×10^8 cfu/μg DNA以上。其高转化效率和稳定性使其在分子生物学实验中起到了关键作用，为基因工程和基因克隆提供了有效的工具。

DH5Α感受态细胞

DH5Α感受态细胞具体步骤如下：

a.将DH5α菌株接种到含有适当抗生素的LB培养基上，37°C培养过夜。

b.取一定量的菌液，离心收集细菌沉淀。

c.用冰预冷的CaCl2溶液重悬细菌沉淀，使其浓度约为10^9 CFU/mL。

d.将重悬后的细菌悬液在冰上放置30分钟。

e.将冰上的细菌悬液离心收集细菌沉淀，弃去上清液。

f.用冰预冷的DMSO溶液重悬细菌沉淀，使其浓度约为10^9 CFU/mL。

g.将重悬后的细菌悬液分装到无菌的冻存管中，每管100μL。

h.将冻存管放入-80°C冰箱中保存，至少需要24小时才能使用。

应用^[4][5]

DH5Α感受态细胞可以用于超声波介导质粒pUC19转化大肠杆菌DH5α感受态细胞转化方法及机制的研究

利用超声波介导质粒p UC19转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)DH5Α感受态细胞。通过对超声波介导外源DNA转化宿主细胞模型的建立、E.coli DH5Α感受态细胞壁成分肽聚糖与金属离子间的吸附关系、超声波处理前后E.coli DH5Α感受态细胞膜通透性的变化、生物大分子物质含量的变化以及E.coli DH5Α感受态细胞外膜蛋白mrd B基因突变株的构建方面进行研究,以期揭示转化发生的机制。研究结果表明,在二价金属离子环境中,适宜条件的超声波可介导外源DNA转化进入宿主细胞。在本实验中当E.coli DH5Α感受态细胞菌液OD600=0.40.6,超声功率为40 W时,在35℃下处理E.coli DH5Α感受态细胞和质粒p UC19的混合液25 s,质粒p UC19转化E.coli DH5α细胞的转化效率最大可以达到1.006×107 CFU/μg DNA。

对超声波处理前后E.coli DH5α细胞膜通透性的变化研究结果显示,在最佳转化条件下细胞膜通透性的变化是未经超声波处理的细胞膜通透性的10倍,然而不同超声波条件下的转化效率的变化与细胞膜通透性的变化不成正比,也与E.coli DH5Α感受态细胞存活率的变化不成正比,这是因为在最佳转化条件菌液OD600值为0.40.6、超声波功率为40 W、在温度为35℃下处理25 s,超声波作用对质粒DNA的完整性没有损伤,对宿主细胞的破坏也很小,但超出此范围后,质粒DNA的完整性受到破坏,同时宿主细胞由于其自身的调控与修复导致转化率的不一致。

E.coli DH5Α感受态细胞壁成分肽聚糖与金属离子、DNA互作结果显示肽聚糖对金属离子的吸附没有专一性,无论是一价(Na+)金属离子还是二价(Mg2+、Ca2+)金属离子,肽聚糖均可与其发生吸附作用,但与DNA不能发生反应,证明在转化发生时必不可少的二价金属离子(Ca2+)有一部分与细胞壁成分肽聚糖发生了反应,为外源DNA进入宿主细胞提供了离子通道,但尚不能证明肽聚糖的存在决定转化的发生。对超声波处理前后宿主细胞E.coli DH5Α感受态细胞中的生物大分子物质检测以及扫描电子显微镜与原子力显微镜观察结果显示,超声波产生的气穴与声穴效应改变了宿主细胞的膜通透性、胞内结构等,导致胞内大分子物质透过细胞膜向胞外溢出,致使超声波处理后的细胞出现褶皱、形态不均等现象。

参考文献

[1]Ultrasound-Microbubble Mediated Cavitation of Plant Cells:Effects on Morphology and Viability[J].Peng Qin;;Lin Xu;;Wenjing Zhong;;Alfred C.H.Yu.Ultrasound in Medicine&Biology,2012(6)

[2]Targeted Gene Transfection from Microbubbles into Vascular Smooth Muscle Cells Using Focused,Ultrasound-Mediated Delivery[J].Linsey C.Phillips;;Alexander L.Klibanov;;Brian R.Wamhoff;;John A.Hossack.Ultrasound in Medicine&Biology,2010(9)

[3]Antibiotic marker modifications ofλRed and FLP helper plasmids,pKD46 and pCP20,for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains[J]..Journal of Microbiological Methods,2008(2)

[4]How does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial transformation process of Escherichia coli?[J].Subrata Panja;;Pulakesh Aich;;Bimal Jana;;Tarakdas Basu.Molecular Membrane Biology,2008(5)

[5]孙尚琛.超声波介导质粒pUC19转化大肠杆菌DH5α感受态细胞转化方法及机制的研究[D].兰州理工大学,2016.