PC-12(高分化)大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(高分化)的应用

背景^[1-3]

PC-12(高分化)大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(高分化)是来自能移植的雄性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤。PC-12(高分化)细胞表达神经生长因子(NGF)受体，NGF可诱导产生神经表型。PC-12(高分化)细胞不合成肾上腺素，生长培养基：RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S。

PC-12(高分化)大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(高分化)

使用方法

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

应用^[4][5]

用于黄芪甲苷通过抑制内质网应激阻止mPTP开放保护PC12细胞研究

探究黄芪甲苷能否通过抑制内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）发挥神经保护作用,并探讨其可能的信号转导机制。

方法（1）高分化的PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）常规培养,为了探究不同浓度的ERS诱导剂2-DG对ERS以及线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,Ψm）产生的不同影响,将细胞随机分成对照组和多种不同浓度（25、50、100、150、200μM）2-DG组,用Western Blot法检测ERS相关蛋白GRP 78、94表达情况,同时使用激光共聚焦显微镜检测TMRE红色荧光强度的改变来判断线粒体通透性转移孔（mitochondrial permeability transition pore,m PTP）开放的情况,以确定2-DG最适浓度。

（2）将细胞随机分成对照组和不同浓度（25、50、75、100μM）黄芪甲苷组,通过Western Blot法检测黄芪甲苷对糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）磷酸化的表达以确定黄芪甲苷最适浓度。

（3）探究黄芪甲苷对ERS的影响,实验分成对照组、2-DG组、黄芪甲苷+2-DG组、黄芪甲苷组。Western Blot法检测ERS相关蛋白GRP 78、GRP 94和IRE1、p-PERK、ATF6的表达以及GSK-3β磷酸化水平;通过激光共聚焦显微镜来检测TMRE红色荧光强度的改变。

结果（1）与对照组比,50μM浓度2-DG组GRP 78、GRP 94的表达增高最为显著,TMRE红色荧光强度减弱最明显,且差异具有统计学意义（P<0.05）,因此后续实验2-DG的浓度采用50μM。

（2）与对照组比,50μM黄芪甲苷组p-GSK-3β表达增多最为显著,具有统计学意义（P<0.05）,因此后续实验黄芪甲苷采用50μM的浓度。

参考文献

[1]A J-Protein Co-chaperone Recruits BiP to Monomerize IRE1 and Repress the Unfolded Protein Response[J].Niko Amin-Wetzel,Reuben A.Saunders,Maarten J.Kamphuis,Claudia Rato,Steffen Preissler,Heather P.Harding,David Ron.Cell.2017(7)

[2]Protective effects of notoginsenoside R1 on cerebral ischemia-reperfusioninjury in rats[J].Shun Zou,Mingxiong Zhang,Limei Feng,Yuanfang Zhou,Li Li,Lili Ban.Experimental and Therapeutic Medicine.2017(6)

[3]The transcription factor XBP1s restores hippocampal synaptic plasticity and memory by control of the Kalirin-7 pathway in Alzheimer model.[J].CisséM,Duplan E,Lorivel T,Dunys J,Bauer C,Meckler X,Gerakis Y,Lauritzen I,Checler F.Molecular psychiatry.2017(11)

[4]IRE1α/XBP1s branch of UPR links HIF1αactivation to mediate ANGII-dependent endothelial dysfunction under particulate matter（PM）2.5 exposure.[J].Xu Xiuduan,Qimuge Aodeng,Wang Hongli,Xing Chen,Gu Ye,Liu Shasha,Xu Huan,Hu Meiru,Song Lun.Scientific reports.2017(1)

[5]蔡建航.黄芪甲苷通过抑制内质网应激阻止mPTP开放保护PC12细胞[D].华北理工大学,2018.