人多功能蛋白聚糖(VS)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人多功能蛋白聚糖(VS)ELISA KIT试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测样品中多功能蛋白聚糖(VS)的浓度。

人多功能蛋白聚糖(VS)ELISA KIT

原理：抗人多功能蛋白聚糖(VS)单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的多功能蛋白聚糖(VS)会与单抗结合，游离的成份被洗去。加入酶标抗体，抗人多功能蛋白聚糖(VS)抗体与结合在单抗上的人多功能蛋白聚糖(VS)结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有多功能蛋白聚糖(VS)，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，多功能蛋白聚糖(VS)浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的多功能蛋白聚糖(VS)浓度。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显**况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

7.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

应用^[4][5]

用于探讨EMT相关基因VCAN在NPM1突变白血病中的表达及其对细胞侵袭能力的影响

多功能蛋白聚糖（versican,VCAN）是一种聚合硫酸软骨素蛋白多糖,是组成细胞外基质的主要部分,在EMT过程中扮演着重要的角色。目前,VCAN高表达已被发现存在于多种实体肿瘤细胞中,并与患者的预后不良密切相关。

筛选NPM1突变白血病中差异表达的EMT相关基因,重点探讨VCAN基因在NPM1突变白血病细胞的表达及其调控机制,观察VCAN高表达对NPM1突变白血病细胞侵袭能力的影响,并分析其临床预后价值。

方法:利用TCGA（the Cancer Genome Atlas）和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库,从中初步筛选出NPM1突变较非NPM1突变白血病细胞差异表达的基因,然后与EMT关键基因取交集,结合白血病患者皮肤浸润的表型特征,最后获得NPM1突变白血病细胞高表达的EMT相关基因VCAN。

采用qRT-PCR及Western blot检测临床样本及白血病细胞系中VCAN mRNA和蛋白的表达水平。TGF-β信号通路抑制剂Ly364947或出核抑制剂LMB处理OCI-AML3白血病细胞后,观察VCAN的mRNA和蛋白表达水平的变化;采用RNA干扰技术下调TGF-β信号通路关键分子PML后观察VCAN表达的改变。

过表达或下调NPM1-mA（NPM1 type A mutation）后检测VCAN水平的变化;在稳定下调NPM1的OCI-AML3细胞中过表达胞浆PML观察VCAN的表达。干扰OCI-AML3细胞中VCAN的表达后,采用CCK8及Transwell实验检测细胞生长及侵袭能力的变化。

参考文献

[1]ZEB1 and ZEB2 transcription factors are potential therapeutic targets of canine mammary cancer cells[J].Pedro L.P.Xavier,Yonara G.Cordeiro,Arina L.Rochetti,Juliano R.Sangalli,Debora A.P.C.Zuccari,Juliano C.Silveira,Fabiana F.Bressan,Heidge Fukumasu.Veterinary and Comparative Oncology.2018(4)

[2]Clinical significance of the TNF-αreceptors,TNFRSF2 and TNFRSF9,on cell migration molecules Fascin-1 and Versican in acute leukemia[J].Nabila El Kramani,Nehal M.Elsherbiny,Amal M.El-Gayar,Mohamed A.Ebrahim,Mohammed M.H.Al-Gayyar.Cytokine.2018

[3]Epithelial–mesenchymal transition（EMT）:A biological process in the development,stem cell differentiation,and tumorigenesis[J].Tong Chen,Yanan You,Hua Jiang,Zack Z.Wang.Journal of Cellular Physiology.2017(12)

[4]Proteoglycans remodeling in cancer:Underlying molecular mechanisms[J].Achilleas D.Theocharis,Nikos K.Karamanos.Matrix Biology.2017

[5]杨丽媛.探讨EMT相关基因VCAN在NPM1突变白血病中的表达及其对细胞侵袭能力的影响[D].重庆医科大学,2019.