大鼠谷胱甘肽S转移酶P(GSTP1)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠谷胱甘肽S转移酶P(GSTP1)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中大鼠谷胱甘肽S转移酶P1（GSTP1）的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠谷胱甘肽S转移酶P1（GSTP1）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠谷胱甘肽S转移酶P1（GSTP1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠谷胱甘肽S转移酶P(GSTP1)

谷胱甘肽S-转移酶是谷胱甘肽结合反应的关键酶，催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤，主要存在于胞液中。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于NOS抑制剂对METH神经毒性的保护作用及GSTP1过表达载体的构建研究

利用体外研究手段,通过腺病毒载体在PC12细胞上建立GSTP1过表达模型,通过调控GSTP1表达,研究其基因水平的改变对METH氧化应激过程中上述通路的调控变化及作用,探索其是否是介导氧化应激致细胞骨架结构损伤和细胞凋亡死亡通路的中间环节。

方法：1.METH中毒模型的建立及NO抑制剂的保护作用1.1METH中毒动物模型的建立及7-NI的保护作用SD大鼠雄性24只,随机分为四组,每组6只：生理盐水组、METH组、METH+7-NI组、7-NI组。动物单笼饲养,自由饮水、取食。实验前先在饲养室适应3天。

组（生理盐水组）：腹腔注射生理盐水,早8：30、晚5：00各一次,连续注射3天；第二组（METH组）：腹腔注射METH,早8：30、晚5：00各一次,连续注射3天；第三组（METH+7-NI组）：注射方法同第二组,提前30min在腹腔注射7-NI；第四组（7-NI组）：注射方法同组,提前30min腹腔注射7-NI,腹腔注射生理盐水。

制成动物模型后,观察行为学变化情况,对大鼠的刻板行为进行评分。应用western blot检测大鼠纹状体nNOS表达、ELISA法检测纹状体多巴胺含量、应用Tunel荧光法检测细胞凋亡。

2.METH中毒细胞模型的建立及L-NAME的保护作用已分化的PC12细胞培养于含10%FBS、双抗（1：100）的高糖DMEM培养基中,37℃、5%CO2培养箱中培养。PC12细胞培养至对数生长期,达约80%汇合时进行实验。

实验分为空白对照组（阴性对照）和实验组,实验组根据L-NAME（N-硝基-L-精氨酸甲酯）浓度的不同而分为5组,各组METH含量均为2.0mmol/L,L-NAME含量分别为0μmol/L（阳性对照）、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。

当细胞生长至80%汇合时,倒去原培养液,实验组加入含上述浓度METH和L-NAME的无血清培养基,对照组换成等体积不含血清和METH的培养基,细胞继续培养24h后。倒置显微镜下观察PC12细胞形态改变,PE Annexin试剂盒、流式细胞术检测细胞凋亡率,NOS检测试剂盒检测细胞总NOS活力,Western blot技术检测GSTP1表达变化。

参考文献

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[2]Gastrodin Protects Apoptotic Dopaminergic Neurons in a Toxin-Induced Parkinson’s Disease Model[J].Hemant Kumar,In-Su Kim,Sandeep Vasant More,Byung-Wook Kim,Young-Yil Bahk,Dong-Kug Choi,Youn Chul Kim.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2013

[3]Norcantharidin enhances ABT-737-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by transcriptional repression of Mcl-1[J].Shuijun Zhang,Gongquan Li,Xiuxian Ma,Yu Wang,Guangzhi Liu,Liushun Feng,Yongfu Zhao,Gong Zhang,Yang Wu,Xuexiang Ye,Baoming Qin,Jianfeng Lu.Cellular Signalling.2012(9)

[4]Inhibition of ATM blocks the etoposide-induced DNA damage response and apoptosis of resting human T cells[J].Z.Korwek,T.Sewastianik,A.Bielak-Zmijewska,G.Mosieniak,O.Alster,M.Moreno-Villaneuva,A.Burkle,E.Sikora.DNA Repair.2012(11)

[5]徐静涛.NOS抑制剂对METH神经毒性的保护作用及GSTP1过表达载体的构建[D].南方医科大学,2013.