人17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中17羟孕酮(17-OHP)水平。用纯化的17羟孕酮(17-OHP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入17羟孕酮(17-OHP)，再与HRP标记的17羟孕酮(17-OHP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的17羟孕酮(17-OHP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中17羟孕酮(17-OHP)浓度。

人17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于高雄激素血症儿童21羟化酶基因分析研究

了解高雄激素血症儿童21羟化酶基因与高雄激素血症的关系。

方法收集43例病例（男7例、女36例）,年龄10.4±2.9岁（5.17-15.83岁）。所有病例均有不同程度高雄激素血症表现、雄激素升高,进行ACTH兴奋试验及基因检查。

根据21羟化酶基因突变结果分为3组：基因正常组（11=18）、无意义基因突变组（n=19）及有意义基因突变组（n=6）。

比较三组17羟孕酮、皮质醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮基础值和ACTH兴奋试验后17羟孕酮、皮质醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮峰值,了解21羟化酶基因与高雄激素血症的关系。

比较有意义突变组ACTH兴奋试验后17羟孕酮峰值与国际标准有无差异,了解我院ACTH兴奋试验在非典型先天性肾上腺皮质增生症诊断中的价值以及17羟孕酮峰值的切割值情况。

结果基因检测结果：43例病例中检测出有意义的基因突变6例,占13.9%,包括：V282L突变3例、1173N突变2例、12g突变1例。无意义突变19例,占44.18%,最常见为c.29-31TGC杂合缺失（34.8%15/43）,第二为S494N突变14例,第三为R103K突变13例。

一种突变暂无文献报道：T124I。在三组之间比较ACTH兴奋试验后的激素峰值水平：有意义基因突变组17羟孕酮基础值（6.55±2.87）及峰值（39.31±29.65）均高于其他两组（P<0.01）。有意义基因突变组皮质醇峰值（708.5±155.53）低于其他两组（P<0.01）。雄烯二酮、脱氢表雄酮基础值及峰值无统计学意义。皮质醇基础值无统计学差异。

有意义基因突变组17羟孕酮峰值与国际诊断标准比较无统计学差异。结论43例高雄激素血症患者中检测出有意义的21羟化酶基因突6例,分别为I173N,V282L、I2g突变。ACTH兴奋试验的17羟孕酮峰值仍然是诊断21羟化酶缺陷症的重要指标。

参考文献

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[2]Premature adrenarche:Etiology,clinical findings,and consequences[J].Raimo Voutilainen,Jarmo J??skel?inen.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.2014

[3]Functional and Structural Analysis of Four Novel Mutations of CYP21A2 Gene in Italian Patients with 21-Hydroxylase Deficiency[J].A.Massimi,M.Malaponti,L.Federici,D.Vinciguerra,M.Manca Bitti,A.Vottero,L.Ghizzoni,M.Maccarrone,M.Cappa,S.Bernardini,O.Porzio.Horm Metab Res.2014(07)

[4]Non-classic congenital adrenal hyperplasia[J].Selma Feldman Witchel.Steroids.2013(8)

[5]朱丹丹.高雄激素血症儿童21羟化酶基因分析[D].重庆医科大学,2015.