LO2人正常肝细胞的应用

背景^[1-3]

LO2人正常肝细胞采用先机械分离后胶原酶-胰蛋白酶联合消化法、并通过专用培养基培养筛选制备而来；细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

L-O2细胞建系鉴定于1980年（叶秀珍等，1980)。该细胞是一株正常肝细胞系，具有典型的肝细胞形态学特征，可用于多种实验研究。

LO2人正常肝细胞

M-肝细胞hepatocyte,hepatic cells,liver cellsLM（光镜）：多面体形；核大而圆,居中,常染色质丰富,部分有双核或多倍体核；胞质嗜酸性,含弥散分布的嗜碱性团块EM（电镜）：

（1）有三种功能面→血窦面→胆小管面→细胞连接面：有紧密连接、桥粒、缝隙连接；

(2)细胞器发达粗面内质网:合成白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原、脂蛋白和补体等血浆蛋白；滑面内质网：参与生物转化和代谢，如胆汁合成、脂类代谢、糖代谢、激素代谢和有机异物的转化；高尔基复合体：参与蛋白的加工和胆汁排泌线粒体、溶酶体和过氧化物酶体丰富；

(3)含糖原、脂滴、色素等内涵物肝细胞核肝细胞核主要由去氧核糖核酸(DNA)和组蛋白等组成。去氧核糖核酸是遗传的物质基础，它有复制遗传信息的功能。患肝炎时，肝炎病毒侵入肝细胞核内，病毒基因可以与肝细胞核中去氧核糖核酸相结合(整合)。一旦整合，HBsAg即难以清除，致使HBsAg长期携带。

此外，去氧核糖核酸还可能以自己为模板合成信使核糖核酸(mRNA)，从而控制细胞质中各种相应蛋白质的合成。肝细胞核如果明显受损，就意味着整个肝细胞崩解毁灭。

线粒体肝细胞的线粒体很多，每个细胞大约有1000个左右，遍布于胞质内。肝小叶不同部位肝细胞内线粒体的大小和形态不完全一致，在正常生理条件下，多为圆形和卵圆形，直径0.4-0.8μm。

线粒体的共同基本形态结构特征是外被双层界膜--外界膜和内界膜，内界膜向线粒体内部伸展转折，形成许多嵴。内界膜将线粒体分隔为内、外两室，外室介于内、外界膜之间，内室则围于内界膜之间，其中充满基质。

应用^[4][5]

用于几种抗癌活性成分对人正常肝细胞LO2毒性的体外实验研究

观察中药活性抗癌成分斑蝥酸钠、没食子酸、熊果酸对人正常肝细胞LO2的影响,为寻找有效的减毒增效拮抗剂提供线索。

方法：采用MTT法检测这三种抗癌活性成分对细胞的增殖抑制,倒置显微镜、荧光染色、电镜检测细胞形态学改变,吉姆萨染色检测细胞微核率,流式细胞术检测细胞凋亡率,western blot检测各用药组细胞内蛋白表达的变化。

结果：发现0.625μg/ml组、1.25μg/ml组、2.5μg/ml组斑蝥酸钠作用24h,对LO2细胞的抑制率分别为为9.1%、17.1%、23.9%；对SMMC-7721的抑制率分别为11.2%、23.5%、30.7%。

荧光显微镜下0.625μg/ml组无明显改变,1.25、2.5μg/ml组LO2出现细胞染色体的断裂；吉姆萨染色后在光镜下计数0.625μg/ml组无明显改变,1.25μg/ml组微核率为46.0‰、2.5μg/ml组为52.2‰；0.625μg/ml组凋亡率为5.08%,1.25μg/ml为16.31%,2.5μg/ml组为21.86%,呈剂量依赖关系；电镜证实2.5μg/ml组出现细胞皱缩、表面微绒毛减少,线粒体肿胀、脊断裂,细胞内空泡增多,细胞核固缩碎裂,呈凋亡特征性改变。

1.25ug/ml和2.5ug/ml组Caspase-3、Bcl-2含量下降,Bax升高,与阴性对照组相比有统计学意义（P<0.05）,NFkb也有所升高,与阴性对照组相比无差异。

熊果酸作用24h,12.5μmol/L组、25μmol/L、50μmol/L组对LO2细胞的抑制率分别为为5.4%,21.4%,49.8%,对SMMC-7721的抑制率分别为17.6%、36.1%、60.9%。

荧光显微镜下50μmol/L组出现细胞核浓缩,亮度增高,形成弯月状,偏向细胞一侧,甚至出现细胞碎片及凋亡小体。

流式结果显示细胞凋亡率为48.76%。没食子酸作用24h,各剂量组均对LO2和SMMC-7721细胞显示出增殖抑制作用,但是到72h后,对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用超过了对LO2细胞的增殖抑制。

没食子酸作用24h后100μmol/L组细胞出现明显的形态学改变,细胞凋亡,凋亡率为12.53%,Caspase-3和P53的表达升高。

参考文献

[1]Ursolic acid and luteolin‐7‐glucoside improve lipid profiles and increase liver glycogen content through glycogen synthase kinase‐3[J].Phytother.Res..2010(S2)

[2]Betulin and ursolic acid synthetic derivatives as inhibitors of Papilloma virus[J].Oxana B.Kazakova,Gul’nara V.Giniyatullina,Emil Yu.Yamansarov,Genrikh A.Tolstikov.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters.2010(14)

[3]Toxicological and pathophysiological roles of reactive oxygen and nitrogen species[J].Ruth A.Roberts,Robert A.Smith,Stephen Safe,Csaba Szabo,Ronald B.Tjalkens,Fredika M.Robertson.Toxicology.2010(2)

[4]Ursolic acid inhibits early lesions of diabetic nephropathy[J].Yi Zhou,Jian-Shuang Li,Xin Zhang,Ya-Jun Wu,Kun Huang,Ling Zheng.International Journal of Molecular Medicine.2010(4)

[5]严晓莺.几种抗癌活性成分对人正常肝细胞LO2毒性的体外实验研究[D].南京中医药大学,2012.