人11去氢血栓烷B2(11-DH-TXB2)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人11去氢血栓烷B2(11-DH-TXB2)ELISA KIT是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中指标的浓度呈比例关系。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于尿液11-脱氢—血栓素B2与2型糖病尿患者大血管病变的相关性研究

糖尿病患者体内血小板处于活化状态,表现为血小板相关止血功能增强,参与糖尿病血管病变的发生发展。血小板活化后,血小板内Ca2+浓度升高,激活磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）和磷脂酶C（phospholipase,PLC）。在PLA2的作用下,将花生四烯酸（arachidonic acid,AA）从磷脂的甘油二位上释放出来。

在PLC作用下,血小板膜磷脂酰肌醇（PI）分解为二脂酸甘油酯（DG）与三磷酸肌醇（IP3）,PI与IP3再经过相关酶的作用分解出AA。AA在环氧化酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1）的作用下转变为前列腺素环内过氧化物,如前列腺素G2、H2（PGG2、PGH2）等。PGG2和PGH2在血小板血栓烷合成酶的作用下生成血栓素A2（thromboxane A2,TXA2）。

TXA2是腺苷酸环化酶的抑制剂,使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）生成减少,从而促进血小板的聚集和血管收缩,引起血液黏度增高及微循环障碍,参与血栓的形成和血管内皮的损伤。因此,可以检测TXA2的含量评价血小板活化程度。但TXA2的半衰期很短（t1/2约30秒）,常规检测技术难以检测,故可以测定其一步转化为无生物活性的血栓素B2（TXB2）的含量。

但血浆中WXB2的含量受多种体外因素的影响,在血液采集和处理过程中少量血小板的体外活化就可明显地增高血浆TXB2的水平。生理条件下TXB2经肝脏氧化酶或脱氢酶代谢形成去二甲基血栓素B2（2,3-dinor-thromboxaneB2,DM-TXB2）以及11-脱氢-血栓素B2（11-dehydro-thromboxaneB2,11-DH-TXB2）并经尿液排出体外。而11-DH-TXB2的半衰期长于DM-TXB2,并且11-DH-TXB2只由体内活化的血小板产生,不易受体外血小板活化的影响,故尿液11-DH-TXB2的含量可直接反映体内TXA2的水平,即可以在一定程度上反映血小板的活化

参考文献

[1]Urinary 11-dehydro-thromboxane B 2 is associated with cardiovascular events and mortality in patients with atrial fibrillation[J].Daniele Pastori,Pasquale Pignatelli,Alessio Farcomeni,Roberto Cangemi,William R.Hiatt,Simona Bartimoccia,Cristina Nocella,Tommasa Vicario,Tommaso Bucci,Roberto Carnevale,Gregory Y.H.Lip,Francesco Violi.American Heart Journal.2015(3)

[2]Anti-inflammatory agents to treat or prevent type 2 diabetes,metabolic syndrome and cardiovascular disease[J].Nathalie Esser,Nicolas Paquot,André,J Scheen.Expert Opinion on Investigational Drugs.2015(3)

[3]LDL oxidation by platelets propagates platelet activation via an oxidative stress-mediated mechanism[J].Roberto Carnevale,Simona Bartimoccia,Cristina Nocella,Serena Di Santo,Lorenzo Loffredo,Giulio Illuminati,Elisabetta Lombardi,Valentina Boz,Maria Del Ben,Luigi De Marco,Pasquale Pignatelli,Francesco Violi.Atherosclerosis.2014(1)

[4]Mental health issues associated with foot complications of diabetes mellitus[J].Christopher Hoban,Jitender Sareen,Christine A.Henriksen,Lorraine Kuzyk,John M.Embil,Elly Trepman.Foot and Ankle Surgery.2014

[5]曲云霄.尿液11-脱氢—血栓素B_2与2型糖病尿患者大血管病变的相关性研究[D].南方医科大学,2016.