氨基甲酸乙酯的含量检测

背景及概述^[1]

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，简称EC），是一种具有遗传毒性及致癌性的物质，对啮齿类动物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。EC广泛存在于发酵食品（如酱油、腐乳等）、酿造酒（如黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒等）和蒸馏酒（如白兰地、威士忌等）中，主要通过酒精类饮料的摄入进入人体内。研究表明氨基甲酸乙酯在生物体内约有0.5%被细胞色素P450氧化为乙酰基氨基甲酸乙酯，再进一步形成乙酰基氨基甲酸乙酯环氧化物，此种物质能够在生物体内形成DNA加聚物，导致DNA结构的双链被破坏，进而导致细胞癌变；另有0.1%左右的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为N-羟基氨基甲酸乙酯，这种物质诱导Cu²⁺调控的DNA损伤，引起癌变。

早在1985年，加拿大卫生与预防部门对酒精类饮料中的氨基甲酸乙酯含量做了强制性限量标准，随后世界其他国家也先后制定了各种饮料酒中的限量标准。同时，采取减少和去除食品中EC前体物质、选用选择性强和特性良好的能降低发酵过程中尿素排泄量的菌株、对发酵过程和蒸馏过程进行工艺改良、对发酵酒进行脲酶和EC降解酶酶法后处理等方法降低成品中EC的含量。各种检测饮料酒以及其他发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的方法也不断发明和改善。

现阶段检测氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄层分析法、傅立叶变换近红外光谱法(FTIR)，近红外光谱技术(NIR)，气相色谱分析法(GC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，气相色谱-串联质谱法(GC/MS/MS)，气相二维或多维色谱-稳定同位素稀释质谱联用技术(GC/GC/CIMS)，气相色谱/热离子检测器法(GC/TSD)，高效液相色谱(HPLC)以及高效液相-荧光法(HPLC-FLD)，液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS/MS)等。

含量检测^[1]

CN201410533042.1报道了一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步骤为：

（1）构建双酶偶联催化体系

a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC NO.5763细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商品酶；

b、酶液以及其他溶液的制备：用25mmol·L^-1 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U·mL^-1和10U·mL^-1；配制540mmol·L^-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L^-1NADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；

c、双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L^-1氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600μL，置于石英比色皿中混合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸光值的变化情况；

（2）双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定：

d、用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；

e、向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L^-1；将所得的溶液体系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应时间为5min；将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线，如图2所示；

f、向模拟黄酒样品（通过向pH 6.0，25 mmol·L^-1PBS缓冲液中添加无水乙醇制备模拟黄酒，酒精度为15%）中添加一定量的氨基甲酸乙酯母液，在双酶偶联反应体系中反应5 min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。

建立的方法能够快速检测并准确定量溶液样品中的氨基甲酸乙酯含量。在模拟黄酒样品中的检测限为0.1 μmol·L^-1，线性相关系数为0.995，样品回收率为95.54%-100.01%，相对标准差为1.634%-4.611%（表1）。

表1检测模拟黄酒样品中氨基甲酸乙酯的回收率以及相对标准差

本发明的有益效果：本发明通过对双酶偶联体系中最适缓冲体系、氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶最适添加量、α-酮戊二酸最适反应浓度等多个实验条件进行优化，建立了快速实时检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法。该方法具有灵敏、快速、简捷、无需昂贵的仪器和复杂繁琐的操作工序等优点，克服了以往方法中的诸多不足。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201410533042.1 一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法