人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)水平。用纯化的人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)，再与HRP标记的解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)浓度。

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于血浆ADAM8水平在COPD分期及严重度评估中临床意义研究

观察解聚素-金属蛋白酶8(ADAM8)在不同分期、不同严重度及不同临床表型的COPD患者的变化,并与其它炎症相关指标作比较,对其临床意义作初步探讨。

方法:以符合GOLD慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2015年版)诊断标准的COPD患者50例作为研究对象。其中慢阻肺急性加重(AECOPD)期患者30例(AECOPD组);稳定期患者20例(稳定期COPD组)。AECOPD患者按是否有喘息症状分为喘息AE组和无喘息AE组。

稳定期患者按气流受限程度分组:符合轻度和中度标准的患者共10例,合并为COPD轻中度组;符合重度和极重度标准的患者共10例,合并为COPD重极重度组。50例COPD患者还按照最近至少4个月内是否使用激素治疗分为长期激素治疗组及无激素治疗组。

选择门诊20例健康体检者的血样本,作为健康体检对照组,以18例社区获得性肺炎(CAP)患者作为CAP对照组,确定其无皮肤过敏史、过敏性鼻炎,近期无重大疾病史。

采用ELISA法检测血浆ADAM8水平,分析不同分组COPD患者血浆ADAM8水平与COPD疾病分期、严重度、喘息表型、长期全身使用激素的关系,同时对不同组血浆ADAM8与患者血常规中WBC、N、E和CRP以及肺功能中FEV1%等指标的相关性进行分析,了解血浆ADAM8对COPD疾病的评估价值。

结果通过比较不同分组COPD患者与健康体检组数据发现,稳定期COPD组、AECOPD组患者的血浆ADAM8、WBC、N、E、CRP及肺功能中FEV1%水平与健康体检组比较均有差异,(P<0.05)。

参考文献

[1]MMP-8,MMP-9 and Neutrophil Elastase in Peripheral Blood and Exhaled Breath Condensate in COPD[J].JieHao Joshua Sng,Silvie Prazakova,Paul S.Thomas,Cristan Herbert.COPD:Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Di.2017(2)

[2]Polymorphisms in a disintegrin and metalloprotease 33 gene and the risk of chronic obstructive pulmonary disease:A meta‐analysis[J].Rui Zhang,He Li,Haiming Zhao,Wangyue Chen,Deyun Cheng.Respirology.2014(3)

[3]Sputum ADAM 8 expression is increased in severe asthma and COPD[J].K.M.Oreo,P.G.Gibson,J.L.Simpson,L.G.Wood,V.M.McDonald,K.J.Baines.Clin Exp Allergy.2014(3)

[4]Clinical phenotypes of chronic obstructive pulmonary disease and asthma:Recent advances[J].Brendan J.Carolan,E.Rand Sutherland.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2013

[5]宋鹏飞.血浆ADAM8水平在COPD分期及严重度评估中临床意义[D].苏州大学,2018.