破伤风梭菌培养基基础的应用

背景^[1-3]

破伤风梭菌培养基基础是专供破伤风梭菌生长的基础培养基，主要用于破伤风梭菌培养及伤风梭菌产毒。破伤风梭菌毒素是破伤风杆菌产生的一种神经蛋白质毒素，通过抑制抑制性神经递质的释放，引起超反射反应和横纹肌痉挛。

典型症状是在肌紧张性收缩(肌强直、发硬)的基础上，阵发性强烈痉挛，通常最先受影响的肌群是咀嚼肌，随后顺序为面部表情肌、颈、背、腹、四肢肌，最后为膈肌。

相应出现的征象为：张口困难(牙关紧闭)、蹙眉、口角下缩、咧嘴“苦笑”、颈部强直、头后仰；当背、腹肌同时收缩，因背部肌群较为有力．躯干因而扭曲成弓、结合颈、四肢的屈膝、弯肘、半握拳等痉挛姿态，形成“角弓反张”或“侧弓反张”；膈肌受影响后，发作时面唇青紫，通气困难，可出现呼吸暂停。破伤风杆菌是引导起破伤风的病原菌，大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。

该菌株在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徙扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇(有腐败臭味)及硫化氢。一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。该菌株在生物技术领域具有一定的应用，然而在常用的培养基中破伤风梭菌增殖速度较慢，同时易发生染菌现象。

应用^[4][5]

用于提高破伤风类毒素免疫原性的初步研究

破伤风梭菌产生的破伤风毒素,经0.4%甲醛灭活后,失去毒性而仍保留抗原性称之为破伤风类毒素。类毒素精制后,可作为疫苗对人和动物进行免疫接种。但机体感染后不能获得终身免疫力,且此免疫程序较长。为了减轻接种的副反应,提高免疫效果,减少注射次数,提高接种覆盖率,采用原核细胞表达具有高免疫原性的重组C蛋白,用于生产疫苗及免疫接种,以避免出现副作用;另外,用双功能交联剂戊二醛聚合破伤风毒素,使毒素分子之间进行交联,从而产生分子量较大的,表面决定簇多的聚合类毒素。

该类毒素作为免疫的抗原,可以诱发较高的抗体水平,加强免疫记忆,延长保护机体免受破伤风的侵害的时间。1.利用PCR技术从破伤风梭菌基因组DNA中扩增出1 356 bp的破伤风毒素C基因,将该基因片段插入到表达载体pET32a(+)中,转化宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,观察各种条件下对重组菌蛋白表达的影响。

对重组后蛋白用Ni-NAT亲和层析的技术纯化C融合蛋白,然后进行小鼠免疫实验并测定效价。研究显示:经SDS-PAGE分析,重组破伤风毒素C蛋白(rTTC)的表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后得到蛋白纯度为96.92%。免疫印迹证实该重组蛋白是破伤风毒素C蛋白抗原,对小鼠免疫,三免后14 d rTTC组小鼠抗体效价仍能达到1∶16 000。所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性。

2.经过厌氧培养的破伤风梭菌,产毒后进行脱毒、精制,在产毒期间进行毒力鉴定、解毒和毒性逆转实验。再由戊二醛聚合破伤风类毒素,经不同的聚合条件的优化,进行分子量和Lf的测定,然后免疫小鼠和兔子,并测定其免疫效价。培养的毒素可以作为制备类毒素使用,脱毒精制后的类毒素,经毒力鉴定试验、解毒试验和毒性逆转试验检测后均合格。

参考文献

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[2]Seroepidemiology of tetanus in Korean adults and adolescents in 2012[J].Hyunwoo Sung,Mi Jin Jang,E Young Bae,Seung Beom Han,Jong-Hyun Kim,Jin Han Kang,Yeon-Joon Park,Sang Hyuk Ma.Journal of Infection and Chemotherapy.2014

[3]Tetanus in Italy 2001–2010:A continuing threat in older adults[J].Antonietta Filia,Antonino Bella,Christina von Hunolstein,Antonella Pinto,Giovanna Alfarone,Silvia Declich,Maria Cristina Rota.Vaccine.2013

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[5]代帆.无动物源破伤风类毒素的生产工艺及在百白破疫苗中效力研究[D].天津科技大学,2016.