人脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)ELISA试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。

用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。

操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及其对肺结核的诊断价值

初步建立提取纯化结核分枝杆菌(M.TB)脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomanan,LAM)的方法,并将其用于血清标本检测,评价其对肺结核的诊断价值。方法M.TB菌体经冰浴超声破碎,乙醇回流,DNase I酶RNase酶除去DNA和RNA,热酚水法去蛋白,氯仿甲醇去酚和脂质,得到粗制的脂多糖。经Sephacryl-100凝胶过滤层析分离纯化,得到LAM。将其作为抗原,通过免疫金渗滤法检测涂阳肺结核和对照血清标本中的LAM抗体。结果所得LAM经SDS-PAGE银染,与对照标准品大小一致,为37 kDa。血清LAM抗体检测对肺结核诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、和涂片符合率分别为91.7%、87.8%、92.7%、86.2%、90.2%。结论成功提取到LAM抗原,用其检测血清结核抗体显示出理想的敏感性和特异性,有望成为结核病血清学快速诊断方法之一。

参考文献

[1]The human macro-phage mannose receptor directsMycobacterium tuberculosisli-poarabinomannan-mediated phagosome biogenesis.Kang PB,Azad AK,Torrelles JB,Kaufman TM,Beharka A,Tibesar E,DesJardin LE,Schlesinger LS.The Journal of Experimental Medicine.2005

[2]Lipoara-binomannan,a possible virulence factor involved in persistenceofMycobacterium tuberculosiswithin macrophages.Chan J,Fan XD,Hunter SW,Brenanan PJ,Bloom BR.Infection and Immunity.1991

[3]Utility of a novellipoarabinomannan assay for the diagnosis of tuberculous men-ingitis in a resource-poor high-HIV prevalence setting.Patel VB,Bhigiee Al,Paruk HF,Singh R.Ce-rebrospinal Fluid Res.2009

[4]A new rapid and simple method for large-scale purification of mycobacterial lipoarabinomannan.Hamasur,B,Kallenius,G,Svenson,SB.FEMS Immunology and Medical Microbiology.1999

[5]彭荣,乐军,金瑞良,景玲杰,韩敏.脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及其对肺结核的诊断价值[J].中国防痨杂志,2011,33(03):149-152.