酸性L-G培养基基础的应用

背景^[1-3]

酸性L-G培养基用于用于碱性物质处理的分枝杆菌标本培养。

成分(g/600ml)：磷酸二氢钾：14.0、硫酸镁：0.24、柠檬酸镁：0.6、L-谷氨酸钠：7.2、孔雀绿：0.4、马铃薯淀粉：30.0。

用法：称取本品52.44g,并吸取甘油12ml,加热搅拌溶解于600ml蒸馏水中,煮沸5-10分钟,121℃高压灭菌15分钟取出。待冷至55℃左右时,以无菌操作加入无菌搅匀的全蛋液1000ml,混匀(避免产生气泡),分装18 mm×180mm试管,每管7ml,置成长斜面,用85-90℃流动蒸汽处理1-1.5小时后，取出放冷备用。

结核分枝杆菌（M.tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli），是人类结核病的病原体。结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。本菌无芽孢、无鞭毛。

培养特性：专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。结核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和温度为36℃±5℃，合适PH值为6.8~7.2的条件下生长旺盛。在一般培养基中每分裂1代需时18～24小时，营养丰富时只需5小时。

应用^[4][5]

用于PhaB法检测MTB利福平耐药性及其耐药基因突变研究

在使用结核分枝杆菌RFP耐药性的噬菌体生物扩增法(Phage Amplified Biologically Assay,PhaB)快速检测方法,探讨和评价此方法在实际检测临床标本应用中的价值;同时对结核分枝杆菌RFP耐药菌株的RFP耐药相关基因rpoB的突变进行研究,对RFP耐药机制进行初步探索,为以后进行RFP耐药机制研究提供相关实验基础。

方法：用抗酸染色法和酸性L-J培养基培养法检测临床痰标本中的结核分枝杆菌,并对分离出来的菌株做菌型鉴定,获得结核分枝杆菌临床分离株。

以绝对浓度法对结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性检测,筛选出对RFP耐药的临床分离株。

应用PhaB法,对108例结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性的测定,并将检测结果与常规绝对浓度法结果进行比较,探讨和评价PhaB法的应用价值。实验第四部分,将结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB进行PCR扩增后对全基因进行测序,对rpoB基因突变进行研究。

结果：对108株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP耐药性测定,常规绝对浓度药敏法检测结果为敏感26株,耐药82株;PhaB法检测结果为敏感24株,耐药84株,与绝对浓度法检测结果符合率为92.59%。如果以绝对浓度法检测RFP耐药性结果为评判标准,则PhaB法测定RFP耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96.34%、77.78%、94.05%、87.50%和92.59%。

参考文献

[1]In Vitro Activity of Fluoroquinolones against Mycobacterium tuberculosis[J].Sulochana,Rahman,Paramasivan.Journal of Chemotherapy.2005(2)

[2]Genetic Susceptibility to Tuberculosis[J].Suneil Malik,Erwin Schurr.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.2002(9)

[3]Identification of Brucella melitensis vaccine strain Rev.1 by PCR-RFLP based on a mutation in the rpsL gene[J].Axel Cloeckaert,Maggy Grayon,Olivier Grépinet.Vaccine.2002(19)

[4]Variations in DNA concentrations significantly affect the reproducibility of RAPD fingerprint patterns[J].A Davin-Regli,Y Abed,R.N Charrel,C Bollet,P de Micco.Research in Microbiology.1995(7)

[5]赛文莉.PhaB法检测MTB利福平耐药性及其耐药基因突变[D].安徽理工大学,2008.