EDTA抗凝血直接PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

EDTA抗凝血直接PCR试剂盒采用独特的PCR缓冲液体系，无需DNA提取或样品处理即可以全血样本为模板进行直接PCR。EDTA、Heparin抗凝全血以及含有血液的采集卡（如Whatman 903®和FTA®采血卡）均可直接用于PCR扩增鉴定，极大的缩短了检测时间。本试剂盒提供的2×Super EasyTM Mix具有很强抑制物耐受性，人血的模板加入量可达45%，鼠血的可达20%，可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA片段。

2×Super EasyTM Mix(UNG)在2×Super EasyTM Mix的基础上用dUTP替代了dTTP，并同时加入能够降解含有dUTP模板的UNG酶(Uracil-N-glycosylase)。在PCR反应前，利用UNG酶降解含有尿嘧啶的PCR产物，UNG酶对不含有尿嘧啶的模板不会造成任何影响，从而保证扩增的特异性和准确性，防止了大规模基因检测时可能出现的PCR产物污染问题。

Taq DNA polymerase是Foregene为直接PCR反应专门研制出的DNA polymerase。D-Taq DNA polymerase对多种PCR反应抑制剂具有极强的的耐受性、在各种复杂反应体系中均能高效扩增痕量的DNA，扩增速度可达2Kb/min，特别适合进行直接PCR反应。

产品特点：

无需进行费时而昂贵的DNA纯化，无需预处理，直接使用全血作为PCR模板。

体系对血液的耐受能力强，可以灵敏的检测出血液中基因组和外源目的DNA片段。

2×Super EasyTM Mix血液耐受度高：人血可达45%，鼠血可达20%。

样本全封闭式操作，无需担心样本污染和PCR结果假阳性。

应用^[4][5]

用于ITP与SLE患者外周血细胞microRNA差异表达的研究

通过比较微小RNAs(microRNAs，miRNAs)在原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）患者和系统性红斑狼疮（systemic lupuserythematosus，SLE）患者外周血细胞中的差异表达，发现ITP患者存在特异性miRNA表达，可为在疾病早期区分ITP与SLE提供相应依据。

方法：原发免疫性血小板减少症患者及系统性红斑狼疮患者各5名，每人抽取外周静脉EDTA抗凝血2ml，Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入Trizol裂解,分别将ITP患者组和SLE患者组的样本混合,提取总RNA。用凝胶电泳验证RNA完整性并用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度及纯度。用miRCURYTMHy3/Hy5试剂盒标记miRNA。应用miRCURYTMLNA Array(v.16.0)试剂盒对Hy3标记样本进行miRNA杂交。

用AxonGenePix4000B miRNA芯片扫描仪进行扫描，GenePix Pro6.0software(Axon)对miRNA信号强度进行分析。对miRNA数据（信号强度≥50）进行中位数标准化，对表达差异的miRNA利用MEV软件(v4.6,TIGR)进行分层聚类分析。从表达差异的miRNA中选取目的miRNA，进行RT-PCR结果验证。

结果：在ITP与SLE组外周血白细胞间发现121个差异表达的miRNAs，其中55个miRNAs仅在ITP组中表达，56个miRNAs仅在SLE组中表达，10个miRNAs在ITP组及SLE组中表达相反，其中4个miRNAs在ITP组中表达下调而在SLE组中表达上调，6个miRNAs在ITP组中表达上调而在SLE组中表达下调。分层聚类分析显示ITP与SLE存在特异性miRNA表达谱。RT-PCR检测结果与芯片分析结果是一致的。

参考文献

[1]Disordered epigenetic regulation in MLL-related leukemia[J].Yue Zhang,Aili Chen,Xiao-Mei Yan,Gang Huang.International Journal of Hematology.2012(4)

[2]Blockade of miR-150 Maturation by MLL-Fusion/MYC/LIN-28 Is Required for MLL-Associated Leukemia[J].Xi Jiang,Hao Huang,Zejuan Li,Yuanyuan Li,Xiao Wang,Sandeep Gurbuxani,Ping Chen,Chunjiang He,Dewen You,Shuodan Zhang,Jinhua Wang,Stephen Arnovitz,Abdel Elkahloun,Colles Price,Gia-Ming Hong,Haomin Ren,Rejani B.Kunjamma,Mary Beth Neilly,Jonathan M.Matthews,Mengyi Xu,Richard A.Larson,Michelle M.Le Beau,Robert K.Slany,Paul P.Liu,Jun Lu,Jiwang Zhang,Chuan He,Jianjun Chen.Cancer Cell.2012(4)

[3]Characterization of human platelet microRNA by quantitative PCR coupled with an annotation network for predicted target genes[J].Abdimajid Osman,Knut Fä,lker.Platelets.2011(6)

[4]The DLEU2/miR-15a/16-1 Cluster Controls B Cell Proliferation and Its Deletion Leads to Chronic Lymphocytic Leukemia[J].Ulf Klein,Marie Lia,Marta Crespo,Rachael Siegel,Qiong Shen,Tongwei Mo,Alberto Ambesi-Impiombato,Andrea Califano,Anna Migliazza,Govind Bhagat,Riccardo Dalla-Favera.Cancer Cell.2010(1)

[5]李哲.ITP与SLE患者外周血细胞microRNA差异表达的研究[D].吉林大学,2013.