RS1大鼠皮肤成纤维样细胞的应用

背景^[1-3]

RS1大鼠皮肤成纤维样细胞来源于一大鼠的皮肤组织。2007年由中国科学院昆明细胞库建立，支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

人皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用。是维持皮肤年轻态的决定性因素，也是维持皮肤结构稳定的重要组成部分。而由此形成的皮肤胶原蛋白修复体系一旦形成，它的生命旺盛周期为10-15年。

RS1大鼠皮肤成纤维样细胞培养操作

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

脑卒中具有高发病率、高死亡率、高复发率和高致残率“四高”特点，是严重威胁人类健康的重大常见疾病。其中，脑出血（ICH）的致死率和致残率比脑缺血高，经常遗留更为严重的持续性神经功能障碍。

现有针对ICH的临床治疗手段，包括药物治疗和外科手术治疗，主要目的是支持治疗和防治并发症，缺乏直接针对ICH病理生理所致损伤的有效特异性治疗手段，治疗效果有限。由于神经元的不可再生性、内源性NSCs数量稀少等原因，神经系统在ICH损伤后自身修复的能力十分有限。

因此，采用干细胞移植治疗以恢复或重建ICH受损的中枢神经系统的结构和功能，已成为近年来倍受研究者们关注的具有极大应用潜力的治疗方案之一。

将重症ICH患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPSCs，接着将iPSCs体外定向诱导分化为NSCs，最后在ICH模型大鼠体内评估iPSCs来源的NSCs移植治疗的效果和可能机制，为利用ICH患者自体iPSCs及其来源的NSCs进行个体化的移植治疗奠定理论和应用基础。

参考文献

[1]Efficient Generation of Neural Stem Cell-Like Cells from Rat Adipose Derived Stem Cells After Lentiviral Transduction with Green Fluorescent Protein[J].Yu Zhang,Na Liu,Yingxin Tang,Erfang Yang,Shasha Dong,Mengyang Huang,Chao Pan,Youping Zhang,Ping Zhang,Hong Chen,Zhouping Tang.Molecular Neurobiology.2014(2)

[2]Comparison of different protocols for neural differentiation of human induced pluripotent stem cells[J].Ali Salimi,Samad Nadri,Marzieh Ghollasi,Khosro Khajeh,Masoud Soleimani.Molecular Biology Reports.2014(3)

[3]Transplantation of Neural Stem Cells That Overexpress Sod1 Enhances Amelioration of Intracerebral Hemorrhage in Mice[J].Takuma Wakai,Hiroyuki Sakata,Purnima Narasimhan,Hideyuki Yoshioka,Hiroyuki Kinouchi,Pak H Chan.Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism.2014(3)

[4]Generation of iPSCs from Genetically Corrected Brca2 Hypomorphic Cells:Implications in Cell Reprogramming and Stem Cell Therapy[J].S.Navarro,V.Moleiro,F.J.Molina‐Estevez,M.L.Lozano,R.Chinchon,E.Almarza,O.Quintana‐Bustamante,G.Mostoslavsky,T.Maetzig,M.Galla,N.Heinz,B.Schiedlmeier,Y.Torres,U.Modlich,E.Samper,P.Río,J.C.Segovia,A.Raya,G.Güenechea,J.C.Izpisua‐Belmonte,J.A.Bueren.Stem Cells.2014(2)

[5]秦洁.诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究[D].郑州大学,2014.