小鼠解整合素样金属蛋白酶9(ADAM9)ELISA KIT的应用
发布日期:2020/5/22 15:45:19
背景[1-3]
小鼠解整合素样金属蛋白酶9(ADAM9)ELISA KIT用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
操作步骤
1、取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。
2、分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔，1个空白对照
3、标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
5、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，如此重复5次，拍干。
7、加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。
8、温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。
10、显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。
11、终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。
12、读板：在450nm波长读取各孔的OD值。
应用[4][5]
用于HTA在肝癌中的表达及与ADAM9、ADAM17表达的相关性研究
通过免疫组织化学技术和ELISA检测HTA作为肝癌肿瘤标志物的价值,分析HTA在肝癌中的表达与临床病理参数的相关性,并结合前期基因芯片的结果,分析HTA与相关差异基因ADAMs表达的相关性,为提高肝癌患者的存活率,改善预后奠定基础。
方法收集13种肿瘤的组织切片,共334例,通过免疫组织化学检测HTA在各种肿瘤中的表达情况,评估HTA作为肝癌肿瘤标志物的价值。
收集32对临床手术切除的肝癌组织、癌旁组织及12例手术切除的血管瘤旁正常肝脏组织,在mRNA和蛋白水平分别验证HTA在肝癌组织中的表达情况,结合临床病案记录,分析HTA表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肝内转移、AFP水平等临床病理资料间的关系。
通过Q-PCR和ELISA及Western blotting在RNA水平及蛋白水平上分别验证HTA与不同细胞系HepG2/si-HTA、HepG2/si-Mock、QSG7701-c、QSG7701-HTA中ADAM9、ADAM17表达的相关性,并采用免疫组织化学验证HTA与ADAM、ADAM17在50例肝癌组织中表达的相关性。
参考文献
[1]Molecular clone and functional study of a novel hepatoma associatedgene[J].Yanhong Liu,Yanjie Zhao,Qiang Ju,Lin Chen,Feng Li,Guohua Zhou,Pingli Xie,Guancheng Li,Yuehui Li.International Journal of Oncology.2013(3)
[2]Cancer statistics,2013[J].Rebecca Siegel,Deepa Naishadham,Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2013(1)
[3]Prospective validation of an immunohistochemical panel(glypican 3,heat shock protein 70 and glutamine synthetase)in liver biopsies for diagnosis of very early hepatocellular carcinoma[J].Silvia Tremosini,Alejandro Forner,Loreto Boix,Ramon Vilana,Luis Bianchi,Maria Reig,Jordi Rimola,Carlos Rodríguez-Lope,Carmen Ayuso,Manel Solé,Jordi Bruix.Gut.2012(10)
[4]VEGF is essential for the growth and migration of human hepatocellular carcinoma cells[J].Lei Zhang,Jia-Ning Wang,Jun-Ming Tang,Xia Kong,Jian-Ye Yang,Fei Zheng,Ling-Yun Guo,Yong-Zhang Huang,Li Zhang,Lin Tian,Shu-Fen Cao,Chang-Hai Tuo,Hong-Li Guo,Shi-You Chen.Molecular Biology Reports.2012(5)
[5]赵艳洁.HTA在肝癌中的表达及与ADAM9、ADAM17表达的相关性研究[D].中南大学,2014.
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