曲霉素琼脂基础(AFPA)的作用和应用研究

背景^[1-3]

曲霉素琼脂基础(AFPA)是一种曲霉菌分离培养分离培养基。曲霉素琼脂基础中蛋白胨、酵母浸粉提供氮源，维生素，生长因子；柠檬酸铁铵，氯硝铵提供必须离子；氯霉素抑制杂菌；琼脂是凝固剂。用法称取本品45.6g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，备用。

黄曲霉aspergillus flavus x=4(a.nidietans)，半知菌类，黄曲霉群的一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。曲霉菌占空气中真菌的12%左右，主要以枯死的植物、动物的排泻物及动物尸体为营养源，为寄生于土壤中的腐生菌。其形态特征是在分生孢子的头部有一个顶囊。已知的曲霉菌至少有170种以上，以Aspergillus fumigatus,Aspergillus terreus,Aspergillus niger,Aspergillus flavus，为其中的代表。各个菌种形成的菌落，颜色不一样，可用以菌种的鉴别。最适生长温度为25-30度。曲霉菌是一种典型的丝状菌，在眼真菌感染症中其比例仅次于镰刀菌，约占全部眼感染症中的10%左右。过去认为它主要引起外源性角膜感染及眼内炎，随着各种免疫功能不全患者的增加，它作为一种内因性的致病菌逐渐引起了人们的重视。

应用^[4][5]

用于棒曲霉素产生菌Penicillium expansum的PCR快速检测及其条件优化研究

PCR(聚合酶链反应)是体外快速扩增核酸的方法,它能使极微量的核酸在数小时之内扩增至原来的数百万倍以上。只要选择合适的引物,PCR就可特异性地大量扩增某一DNA片断至易检测水平。利用此原理,可以通过特异性地扩增某种微生物的基因片断而实现快速检测目的。实验通过Penicillium expansum 3.3703的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase基因的两对引物扩增Penicillium expansum DNA的基础上,建立特异和快速的检测Penicillium expansum的方法;之后研究实时PCR扩增时退火温度、引物浓度以及模板浓度对扩增效果的影响,以获得的参数。通过研究得到以下结论:(1)基于polygatacturonase基因的引物Ⅱ(POL)具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物Ⅰ(ISO)扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6μgDNA/每反应体系,整个检测时间大约为5h,比传统的培养法时间(4～6d)大大缩短;(2)苹果、苹果果肉和果汁接种纯Penicillium expansum后所提DNA都得到了很好地扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰;(3)用lightercycler实时PCR扩增Penicillium expansum DNA的退火温度大约为61℃,引物的浓度约为0.20～0.40μmol/L,底物浓度对实时PCR扩增的影响较小。在以上参数下,可以获得良好的PCR扩增曲线、产物溶解曲线以及清晰的产物条带。本研究建立的Penicillium expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中Penicillium expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对Penicillium expansum污染的快速溯源。本研究获得的Penicillium expansum的实时PCR的较优参数,可作为其它微生物实时PCR检测时的方法学参考,也可用于苹果浓缩汁工业化生产中Penicillium expansum的快速检测和质量控制。

参考文献

[1]PCR detection assays for the ochratoxin-producing Aspergillus carbonarius and Aspergillus ochraceus species[J].International Journal of Food Microbiology.2005(2)

[2]PCR identification system for the genus Aspergillus and three major pathogenic species:Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus and Aspergillus niger[J].Chise Sugita,Koichi Makimura,Katsuhisa Uchida,Hideyo Yamaguchi,Atsushi Nagai.Medical Mycology.2004(5)

[3]The isoepoxydon dehydrogenase gene of patulin biosynthesis in cultures and secondary metabolites as candidate PCR inhibitors[J].R.Russell Paterson.Mycological Research.2004(12)

[4]苹果浓缩汁（AJC）生产中棒曲霉素产生菌的分离鉴定及控制技术研究[D].苏青峰.西北农林科技大学2005

[5]毕静莹.棒曲霉素产生菌Penicillium expansum的PCR快速检测及其条件优化[D].西北农林科技大学,2007.