醋酸布雷默浪丹的制备方法

概述^[1-3]

醋酸布雷默浪丹(Bremelanotide)为环七肽结构。大量研究已证实它们的受体分子在性唤起、降低食欲以及催化黑色素的合成中起着重要的作用，由此可以治疗性功能障碍、肥胖以及刺激皮肤产生黑皮素抵抗紫外线灼伤等疾病。PT-141是美国Palatin公司开发的一种治疗性功能障碍的药物，目前已完成III期临床，对男女患者都有效，尤其是女性性冷淡患者唯一有效的候选药物。

制备方法^[2]

现有的醋酸布雷默浪丹合成方法以固相合成为主，中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法，首先固相合成带保护基的普美拉肽，其次在树脂上环化普美拉肽，然后从树脂上切割纯化，再转化为醋酸普美拉肽，收率为17%。中国专利200610086841.4公开了PT-141的固相合成方法，该发明通过选择性的保护了部分氨基酸，合成七肽后脱除部分侧链保护基，采用不同的环合顺序环化，裂解纯化后得到目的产物，收率为40%以下。上述为醋酸布雷默浪丹的合成主要方法，存在合成路线长，步骤多，合成路线单一，耗时长，成本高，收率不高等问题，而且合成过程中个别氨基酸的官能团保护基相互干扰，极大的增加了官能团保护基的反应选择性。

1.制备PAS-树脂

将Fmoc-Linker-AM树脂用DMF洗过两次，然后用DCM浸泡10分钟左右，使树脂充分溶涨，加入25％的哌啶，反应20分钟，抽干，用DMF和DCM各洗三遍，加入用DMF溶解好的PAS/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，然后用DMF和DCM交替着洗三遍，就得到了PAS-树脂。所用的氨基酸和缩合试剂的量是树脂的摩尔系数的两倍过量；以下过程同。

2.制备Fmoc-Lys(Boc)-PAS-树脂

在上面的步骤后，加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，抽干，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Boc)-OH/HOBt/DIC/DMAP的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，然后用DMF和DCM交替着洗三遍，就得到了Fmoc-Lys(Boc)-PAS-树脂。由于在这一步中是酯化反应，一般过程中的反应不是很完全，为了避免在后续的反应过程中没反应完全的继续反应，所以这一步要进行适当的封闭，在一过程中，只需要加入适量的丙酸酐，继续反应30分钟基本就可以了。DMAP的量仅为摩尔系数的0.1倍即可。

3.制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤2.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Trp-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时后，抽干，用DMF和DCM交替着洗三遍，即得到了Fmoc-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

4.制备Fmoc-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤3.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的

Fmoc-Arg(pbf)-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时后，抽干，用DMF和DCM交替着洗三遍，即得到Fmoc-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

5制备Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤4.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-D-Phe-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

6.制备Fmoc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤5.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-His(trt)-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

7.制备Fmoc-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤6后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Asp(Otbu)-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

8.制备Fmoc-Nle-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤7后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Nle-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-Nle-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

9.制备AC-Nle-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂

在步骤8后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍后，加入已经配比好的1∶2∶3的吡啶，醋酸酐，和N，N-二甲基甲酰混合液反应30分钟，然后抽干，用DMF和DCM交替着洗三遍，即得到AC-Nle-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys(Boc)-PAS-树脂。

10.制备AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-PAS-NH2

在步骤9后把AC-Nle-Asp(Otbu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp-Lys-PAS-树脂加入预冷的已配比好的弱酸TFA切割试剂，进行搅拌在35℃左右反应大概2小时后，滤出溶剂，加入预冷的乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗2-3次；在干燥器中减压干燥3小时左右，即得到醋酸布雷默浪丹的线性粗品：AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-PAS-NH2。

11.制备

在步骤10.后制备得到了线性AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-PAS-NH2产品后；用DMF把线性产品溶解，浓度大概在6mmol/l左右，然后加入三倍摩尔数的PyBOP和DIEA，充分搅拌均匀，静止10分钟左右，让固体都充分溶解后，把溶液放进冷冻冰柜中，温度控制在-20℃左右，然后让它静置12-24小时；过程中可以用高效液相进行监控。确认反应完全后，则得到。

拿出来加入三倍体积的超纯水；过程中放热很厉害，注意控制热量不要使局部过热；稀释好了后加配置好的稀NaOH溶液，使溶液的PH值在10左右，然后搅拌半小时后，经过检测，完全水解完毕则得到。然后加酸中和。

主要参考资料

[1] 李瑞敏. (2010). 黑皮素类似物和瑞林类寡肽药物的合成研究. (Doctoral dissertation, 天津大学).

[2] 女人也会有“伟哥”. 健康必读(06), 62.

[3] 卡尔・斯帕纳, 罗伯特・乔丹, & 杰弗里・D・埃德尔森. . 用于女性性功能障碍的布雷默浪丹疗法.