如何制备醋酸利那洛肽

概述

1970年人们首次发现外源性耐热性肠毒素(heat-stableenterotoxin，STa)能够激活小肠上皮细胞的某种受体进而引起分泌性腹泻。1990年确定该受体为GC-C，而后进一步明确了体内天然的GC-C激动剂有鸟苷蛋白(Guanylin)和尿鸟苷素(Uroguanylin)。2005年首个人工合成的GC-C激动剂利那洛肽在Ⅰ期临床试验中证明了其可提升粪便硬度和质量，于2012年被美国FDA和欧洲EMA批准用于治疗成人IBS-C，2019年在中国上市。

制备[3]

醋酸利那洛肽制备如下：

步骤1：Fmoc-Tyr(tBu)-2-ClTrt-树脂的合成

取500g取代值为0.6mmol/g的2-ClTrt-Cl树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.6molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.2molDIPEA，搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2-ClTrt-树脂，取代值为0.45mmol/g。

步骤2：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的合成

取500g取代值为0.5mmol/g的Wang树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.5molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.0molDIC、0.4molHOBt、0.04mol4-N，N-二甲基吡啶，搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，取代值为0.39mmol/g。

步骤3：利那洛肽肽树脂的制备

取0.1mol步骤2的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang-树脂(取代值0.39mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Tyr(tBu)-Wang-树脂。取0.3molFmoc-Cys(Trt)-OH和0.3molHOBt，用适量DMF溶解，另取0.28molHBTU，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，再加入0.56molDIEA，混匀后加入到上述H-Tyr(tBu)-Wang-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-树脂。同上法依次接入表3剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：

H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-树脂

步骤4：利那洛肽线性肽粗品的制备

取利那洛肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得利那洛肽线性肽粗品，纯度为84.7％。

步骤5：利那洛肽粗品纯化

取利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得利那洛肽纯化中间体浓缩液；取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到醋酸利那洛肽，冷冻干燥，得利那洛肽纯品66.4g，总收率为43.5％，分子量：1527.8(100％M+H)，纯度：99.3％，单一杂质为0.09％。

主要参考资料

[1] CN201710672918.4一种利那洛肽的纯化方法

[3] CN201510314459.3一种合成利那洛肽的方法