T1感受态细胞的特点

背景^[1-4]

T1感受态细胞是采用大肠杆菌Mach1-T1 Phage Resistant菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。

使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达1010cfu/μg DNA。Mach1-T1 Phage Resistant感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，在氨苄青霉素平板上，8-9 h可见克隆。用于蓝、白斑筛选，12 h可见蓝斑。具有T1，T5噬菌体抗性。

基因型：F-φ80(lacZ)ΔM15ΔlacX74hsdR(rkmk+)ΔrecA1398endA1tonA

特点

1、Mach1-T1 Phage Resistant感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，在氨苄青霉素平板上，8-9 h可见克隆；

2、用于蓝、白斑筛选，12 h可见蓝斑；

3、将过夜培养的单克隆在2 ml的LB培养基中培养4-5 h即可进行小量质粒提取；

4、适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA的产量和质量；

5、具有T1，T5噬菌体抗性。使用pUC19质粒检测，转化效率可达109cfu/μg。

操作方法

1.从-80℃冰箱取出感受态细胞，立即置于冰上。

2.待感受态细胞解冻后，取10μl连接产物与100μl感受态细胞混匀，冰浴20-30min。

3.42℃水浴热激45s，立即置冰上放置2min。

4.加入预热至室温的400μl LB培养基（无抗生素），37℃恒温摇床培养1h。

5.取100μl菌液均匀涂布于含相应抗生素抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

应用^[5][6]

用于慢病毒介导PTL基因干预的星形胶质细胞在帕金森病模型中的保护作用研究

构建胰甘油三酯脂酶(pancreatic triglyceride lipase,PTL)基因RNA干扰慢病毒载体和胰甘油三酯脂酶基因慢病毒过表达载体及鉴定，并进行包装和生产高滴度高纯度的慢病毒颗粒。方法：针对PTL基因序列，合成4对靶向大鼠PTL基因特异性干扰序列，其两端含酶切位点粘端，直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体pLenO-THM上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR鉴定和测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的重组慢病毒干扰质粒。以钙转法将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，包装生产慢病毒颗粒，并依据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测病毒滴度；从含有PTL基因的质粒克隆模板PCR扩增后，将PTL基因与pLenO-DCE载体分别进行双酶切。纯化酶切产物后进行定向连接或重组，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR鉴定、测序和分析比对，得到构建成功的PTL慢病毒过表达载体，将其转染293T细胞，培养48h后，荧光显微镜观察融合蛋白GFP/PTL的表达。同时收集细胞培养上清液，将其浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度。

参考文献

[1]Delayed transplantation of precursor cell‐derived astrocytes provides multiple benefits in a rat model of P arkinsons[J].Christoph Proschel,Jennifer L Stripay,Chung‐Hsuan Shih,Joshua C Munger,Mark D Noble.EMBO Mol Med.2014(4)

[2]Structural insights from GRP78–NF-κB binding interactions:A computational approach to understand a possible neuroprotective pathway in brain injuries[J].Marco Fidelávila,Daniel Torrente,Ricardo Cabezas,Ludis Morales,Luis Miguel García-Segura,Janneth Gonzalez,George E.Barreto.Journal of Theoretical Biology.2013

[3]Modeling astrocytic contribution toward neurodegeneration with pluripotent stem cells:focus on Alzheimer’s and Parkinson’s diseases[J].Federica Rinaldi,Maeve A.Caldwell.NeuroReport.2013(18)

[4]DJ-1 Associates with lipid rafts by palmitoylation and regulates lipid rafts-dependent endocytosis in astrocytes[J].Kwang Soo Kim,Jin Soo Kim,Ji-Young Park,Young Ho Suh,Ilo Jou,Eun-Hye Joe,Sang Myun Park.Human Molecular Genetics.2013(23)

[5]Parkinson’s Disease-Associated Dj-1 Mutations Increase Abnormal Phosphorylation of Tau Protein through Akt/Gsk-3βPathways[J].Yangang Wang,Weiping Liu,Xiaosheng He,Fei Zhou.Journal of Molecular Neuroscience.2013(3)

[6]张晔.慢病毒介导PTL基因干预的星形胶质细胞在帕金森病模型中的保护作用研究[D].苏州大学,2014.