芳姜黄酮的药理作用

概述^[3-4]

芳姜黄酮是姜黄油的主要的成分,具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等活性。其抗炎机理是通过调控JNK、p38 MAPK、ERK1/2的磷酸化水平以及PI3K/Akt信号通路,影响NF-κB的活性,控制内源性炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)以及其他相关致炎因子的表达。

制备^[4]

芳姜黄酮的分离纯化

 1 硅胶柱层析分离 取姜黄挥发油 10 g，用石油醚溶解， 置于瓷蒸发皿中， 以 12 g 硅胶拌样， 挥干溶剂后湿法上柱，石油醚-乙酸乙酯 ( 15∶1) 开始洗脱，TLC 展开剂为石油醚-乙酸乙酯( 15∶1)， 254 nm下观察。根据 TLC 显示结果，收集 Rf = 0. 7 处的混合物，得到组分 17. 3 g，继续以石油醚-乙酸乙酯 ( 50∶1) 洗脱，收集 Rf = 0. 5 处的混合物，得到组分 2 5. 2 g。然后， HPLC 法对组分 2 进行定性分析，色谱柱为 Hedera C18 ( 4. 6 mm×200 mm，5μm) ; 流动相为甲醇-水 (90∶10) ; 柱温 25 ℃ ; 检测波长 254 nm;进样量 15μL，结果见图 1。

2 制备型HPLC色谱分离

应用制备型 HPLC 色谱柱对 Fr．2 进 行 分 离， 色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18( 21. 2 mm×250 mm，5μm) ; 流动相甲醇-水 ( 80 ∶ 20) ; 体积流量 10 mL /min; 检测波长 254 nm; 进样量 0. 4 mL。结果， 共收集得到 3 个组分，浓缩蒸干，即得组分1、组分 2和组分 3， 然后对其进行 EI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR 测定。

3 结构确认

通过 EI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR 测定，确定组分 1 为芳姜黄酮。其中， EI-MS m/z: 216 ( M +，6) ，201 ( M + -Me， 7 ) ，132 ( 11 ) ，119 ( 44 ) ， 91 ( 25 ) ， 83( 100)， 77 ( 14)，55 ( 70) ，与谱库中芳姜黄酮数据的匹配率为 98% 。¹H-NMR ( CDCl₃， 400 MHz) δ: 1. 17 ( 3H， d，J = 7. 2 Hz)，1. 78 ( 3H， d，J = 1. 2 Hz)，2. 03 ( 3H，d，J =0. 8 Hz)，2. 23 ( 3H，s)，2. 50- 2. 56 (1H，m)，2. 61- 2. 66( 1H，m)，3.19- 3. 24 ( 1H，m)，5. 95 ( 1H，dd，J = 1. 2，0. 8 Hz)，7. 03 ( 4H，d，J = 1. 2 Hz) 。¹³C-NMR ( CDCl₃，100 MHz) δ: 20. 7，21. 0，22. 0，27. 7， 35. 3， 52. 7，124. 1，126. 7，129. 1，135. 6，143. 7，155. 1，199. 9。

药理作用^[1-2]

罗梦颖等人研究了芳姜黄酮对子宫颈癌SiHa细胞体外增殖、迁移与侵袭的作用,并初步探讨其机制。方法：体外培养SiHa细胞,不同浓度芳姜黄酮（0、20、40、80 mg/L）作用于细胞后,采用CCK8法检测SiHa细胞体外增殖情况;吉姆萨染色显微镜观察SiHa细胞凋亡情况;细胞划痕实验和Transwell小室检测SiHa细胞体外迁移和侵袭能力;流式细胞术分析确定SiHa细胞的诱导凋亡率; Western blotting检测SiHa细胞MMP2、MMP9及p53蛋白表达。

结果芳姜黄酮可抑制SiHa细胞的体外增殖(F浓度=162. 419,P <0. 001; F时间=99. 442,P <0. 001; F浓度×时间=2.111,P=0.095)、迁移(F浓度=432.158,P<0.001; F时间=528.845,P<0.001)和侵袭(F浓度=434.362,P<0.001),且与其浓度、作用时间呈正相关;流式细胞仪分析表明,芳姜黄酮可诱导SiHa细胞凋亡(F浓度=482.690,P<0.001),且与其浓度呈正相关; Western blotting检测结果表明,经芳姜黄酮处理后,凋亡相关蛋白p53的表达明显上调(F浓度=2.086,P=0.045)、侵袭和转移相关蛋白MMP2、MMP9的表达下调(F浓度=18.906,P=0.001; F浓度=9.847,P=0.005)。

结论：芳姜黄酮具有抑制SiHa细胞体外增殖及诱导细胞凋亡的能力,其机制可能与调节凋亡相关蛋白p53表达有关;芳姜黄酮可能通过调节侵袭和转移相关蛋白MMP2、MMP9的表达,进而抑制SiHa细胞迁移与侵袭。

王叶研究了芳姜黄酮(Ar-Turmerone)对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,明确芳姜黄酮抗皮肤鳞状细胞癌的活性,并探讨其促凋亡机制是否通过Notch1/Hes1/PTEN通路实现。

方法:(1)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测增殖抑制率:用0、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/L浓度的芳姜黄酮分别作用于A431细胞24、48、72 h,CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,并计算芳姜黄酮对A431细胞增殖的半数抑制浓度(IC 50);(2)吉姆萨染色观察细胞凋亡形态:根据增殖抑制率选择20、40、80 mg/L的芳姜黄酮处理A431细胞24 h,吉姆萨染色观察细胞发生凋亡时的形态变化;(3)划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力:根据CCK-8实验结果,选择对细胞增殖抑制作用较小的药物浓度。将5、10 mg/L的芳姜黄酮作用于A431细胞24、48 h,划痕实验观察细胞的体外迁移能力,Transwell小室实验评价细胞体外侵袭能力变化;(4)流式细胞仪检测细胞凋亡率:20、40、80 mg/L的芳姜黄酮作用于细胞48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;(5)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR,rt-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测mRNA及蛋白表达:20、40、80 mg/L的芳姜黄酮作用于细胞48 h后,rt-PCR法检测Notch1、Hes1、PTEN mRNA表达,WB检测三者蛋白表达;(6)芳姜黄酮通过Notch1/Hes1/PTEN通路调节凋亡:(1)分组和处理:分为空白组(未作任何处理的A431细胞)、阴性对照组(阴性siRNA转染的A431细胞),加药组(以20 mg/L的芳姜黄酮作用于A431细胞48 h)、siRNA组(siRNA转染细胞),siRNA+药物组(以20 mg/L的芳姜黄酮作用于转染后的A431细胞48 h);(2)用Notch1 siRNA转染A431细胞,按(1)分组及处理,检测Hes1的mRNA与蛋白表达;(3)同样用Hes1 siRNA转染A431细胞,按(1)分组及处理,检测PTEN的mRNA与蛋白表达;(以上mRNA表达均用rt-PCR法检测,蛋白表达均用WB法检测);(4)用PTEN siRNA转染A431细胞,按(1)分组及处理,再次用流式细胞仪检测凋亡率。

结果:(1)芳姜黄酮对于A431细胞在24、48、72 h的IC 50分别为124.67、98.82、72.16 mg/L,随着实验中芳姜黄酮浓度的增加和作用时间的延长,对A431细胞的增殖抑制率也逐渐增加(P<0.05和P<0.01),且呈一定的时间-剂量依赖关系;(2)芳姜黄酮处理A431细胞后,吉姆萨染色可见细胞正常形态消失,细胞间隙增加,随着药物浓度的增加,细胞贴壁性降低,核碎裂及细胞形态变化更加明显;(3)芳姜黄酮5、10 mg/L作用于A431细胞24、48 h后,具有体外抑制A431细胞侵袭、迁移的能力(P均<0.05)。(4)流式细胞仪检测到A431细胞被20、40、80 mg/L的芳姜黄酮处理后的凋亡率分别为(8.30±0.36)%、(16.37±0.46)%、(30.48±1.08)%,与对照组相比,凋亡率增加(P均<0.01);(5)(1)20、40、80 mg/L芳姜黄酮作用于A431细胞48 h后,Notch1,Hes1和PTEN的mRNA和蛋白的表达均高于对照组,呈剂量依赖性(P均<0.01);(6)(1)沉默Notch1后,siRNA+药物组中Hes1的mRNA和蛋白表达均低于单纯给药组(P均<0.01);(2)沉默Hes1,siRNA+药物组中PTEN的mRNA和蛋白表达量均低于单纯给药组(P均<0.01);(3)沉默PTEN后,siRNA+药物组与单纯给药组相比,细胞凋亡率降低(P均<0.01)。

结论:芳姜黄酮可抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖,促进细胞凋亡;具有体外抑制其迁移和侵袭的作用;芳姜黄酮促进人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡的机制之一是通过Notch1/Hes1/PTEN的通路实现的。

主要参考资料

[1] 罗梦颖,吴蓓,王叶,骆衡,曹煜.芳姜黄酮对SiHa细胞增殖、迁移及侵袭的影响[J].山东大学学报(医学版),2019,57(06):68-74.

[2] 王叶. 芳姜黄酮通过Notch1/Hes1/PTEN通路诱导人皮肤鳞状细胞癌A431凋亡[D].贵州医科大学,2019.

[3] 黎永良. 芳姜黄酮抗银屑病作用及机理研究[D].广东工业大学,2017.

[4] 石洋,潘博文,王慧娟,刘雄伟,曹煜,刘雄利,周英.芳姜黄酮对照品制备[J].中成药,2016,38(02):464-466.