恩他卡朋（Entacapone）抑制FTO来调节FOXO1介导的糖脂代谢

1. 文章来源介绍

北京生命科学研究所（NIBS）黄牛实验室于2019年4月17日在Science Translational Medicine杂志发表了题为“Identification of entacaponeas a chemical inhibitor of FTO mediating metabolic regulation through FOXO1”的文章(Peng et al., 2019)。该文章发现，恩他卡朋（Entacapone）通过抑制肥胖及肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated gene, FTO），进而影响转录因子FOXO1来调节相应的糖脂代谢。

2. 研究背景及科学问题

肥胖和糖尿病以能量稳态受损和机体代谢紊乱为特征，并已成为现代社会严重的流行病。肥胖及肥胖相关基因（FTO）本身是一个去甲基酶，主要执行m6A的去甲基化功能，全基因组关联研究已经确定它是与肥胖和糖尿病等表型相关的遗传因素(Yang et al., 2012)。在小鼠模型上，过表达Fto基因会导致肥胖表型(Church et al., 2010)，而将其敲除则能够导致小鼠体重降低(Fischer et al., 2009)，然而这其中的具体分子机制还不清楚。另外，目前也没有作用于FTO的小分子抑制剂来治疗肥胖和糖尿病等代谢性疾病。 针对上述未解决的问题，作者设计实验进行了药物筛选和后续的机制探索研究。

3. 主要技术方法

药物筛选方面，作者使用了基于结构基础的虚拟筛选和生化验证实验相结合的方法，从1323个FDA批准的化合物中筛选出了FTO的特异性抑制剂；机制方面，作者主要通过细胞模型（Hep-G2）、肥胖小鼠模型（食物诱导的肥胖模型和db/db模型）和转基因小鼠模型（Foxo1基因突变小鼠和肝脏特异性Fto基因敲除小鼠）等进行了探索。

4. 重要发现

1) 虚拟筛选和生化实验证实恩他卡朋是FTO的抑制剂

为了寻找FTO的抑制剂，作者采用虚拟筛选的方法对1323个FDA批准的化合物进行了筛选，最终筛到一个候选化合物——恩他卡朋，并且发现其作用于FTO的半抑制浓度（IC50）为3.5 μM，当使用其处理Hep-G2细胞时，胞内的m6A水平是显著升高的。作者进一步解析了结合有恩他卡朋时的FTO的晶体结构，发现二者结合时，恩他卡朋可以占据FTO用来结合辅助因子和底物的结合位点，该结果提供了有力的依据，从结构基础上证实了恩他卡朋的确能够有效的抑制FTO的活性。

2) 恩他卡朋能够减轻小鼠体重并降低小鼠肝脏葡萄糖生成

由于FTO已经确定与肥胖和糖尿病等代谢异常情况相关，而作者前文又证实恩他卡朋是FTO的抑制剂，所以这就促使他们进一步去研究恩他卡朋是否能够用于改善肥胖和糖尿病等代谢异常情况。实验发现，在野生型小鼠中，食物中添加恩他卡朋能够有效的降低高脂食物诱导的肥胖表型，比如脂肪组织的重量和脂肪指数（脂肪组织重量/体重×100%）都比对照组有显著降低；同时，恩他卡朋处理还能够增加小鼠的能量消耗以及降低血液总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯以及血糖的水平；在db/db小鼠中，恩他卡朋处理不但够显著降低血糖水平，而且还能改善小鼠葡萄糖不耐受的情况；此外，作者在肝脏特异性敲除Fto的小鼠中也观察到了类似于恩他卡朋处理db/db小鼠的表型。由于肝脏特异性敲除Fto的小鼠其血液胰岛素水平和对照小鼠相比并没有差异，但是其血糖水平又是降低的，所以作者认为肝脏FTO能够调节糖异生过程，而恩他卡朋能够通过抑制FTO来抑制糖异生。

3) FTO通过调节FOXO1的mRNA甲基化水平来影响小鼠葡萄糖生成和产热

在上述实验结果的基础上，作者进一步探索了其中的分子机制。他们在FTO敲低的Hep-G2细胞中做了RNA-seq，结果发现糖代谢通路是有显著变化的，其中的关键基因，如G6pc和Pck1是显著下调的。已有文献报道这两个基因的转录因子是FOXO1，因此他们顺藤摸瓜，通过实验证实FTO能够促进FOXO1 mRNA的去甲基化。由于FOXO1在肝脏组织中能促进G6pc表达，在脂肪组织中能够抑制Ucp1的表达，因而这种去甲基化在肝脏组织中是促进糖异生、在脂肪组织中是抑制产热的。反之，当用恩他卡朋将FTO特异性抑制时，则在肝脏中抑制了糖异生、在脂肪组织中促进了产热，这对改善机体的代谢紊乱是极其有利的。

5. 重要性或对领域贡献

Fto是一个编码去甲基化酶的基因，目前的研究已经证实其与肥胖和糖尿病等代谢性疾病高度相关，因此它可能是一个潜在的治疗代谢紊乱的靶点。但是由于其具体的底物未知，因此其如何参与调节机体代谢也不清楚；另外，目前也没有可以抑制FTO的小分子化合物，这也限制了其作为靶点在治疗代谢性疾病方面的应用。本研究的重要贡献恰恰在于其成功的回答了上述两个问题：一方面，发现FOXO1 mRNA是FTO在调节代谢紊乱过程中的直接底物；另一方面，发现作为FDA批准辅助治疗帕金森疾病的恩他卡朋也是FTO的小分子抑制剂。

6. 存在问题及分析

尽管本研究回答了关于FTO的两个重要问题，但是诚如文章中所言，该研究也存在着一些局限性。首先，由于人和小鼠是不同的物种，其脂肪组织，尤其是相应的代谢水平是存在差异性的，因此还需要进一步在人相关的细胞系、非人灵长类甚至人本身中进行实验来验证恩他卡朋通过抑制FTO来调节代谢水平的可靠性；其次，由于恩他卡朋在血液中的消除半衰期（elimination half-life）大约只有0.5小时，因此在使用它治疗代谢紊乱时还需要从药物动力学和药效学方面对其加以改进。