细胞RNA提取

细胞中提取总RNA的方法是用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，异硫氰酸狐是一种常见且有效的蛋白质变性剂，在裂解细胞的同时能有效抑制内源性RNA酶活性。同时加入氯仿产生了第二相（有机相），DNA和蛋白质在有机相中被抽提，低pH值的酚将使RNA留在上层水相中。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩,随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，最终获得总RNA。 (1)样品加入单相裂解液后，室温放置5 min,使样品充分裂解。如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。 (2)如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等，12000 rpm离心5 min,取上清。 (3)按每1mL单相裂解液加入200μL氯仿，振荡混匀后室温放置15 min,使其自然分相。禁用旋涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 (4)4℃12 000 rpm离心15 min后，样品会分成三层，黄色的有机层，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。 (5)小心吸取上层水相，至另一个新的1.5 mL离心管中。不要吸取中间界面，以免DNA和蛋白污染。 (6)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，-20℃放置1h以增加RNA沉淀。 (7)4℃12 000 rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。 (8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇（用DEPC水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀。 (9)4℃8 000 rpm离心5 min,尽量弃上清。用移液器小心吸弃上清，注意不要吸走RNA沉淀。 (10)室温晾干5〜10 min,让最后残存的痕量乙醇挥发。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 (11)用50μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀，RNA溶液要放在-70℃保存。纯水和TE均需DEPC处理并经高压消毒。