细胞RNA提取的应用

背景^[1-6]

细胞中提取总RNA的方法是用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，异硫氰酸狐是一种常见且有效的蛋白质变性剂，在裂解细胞的同时能有效抑制内源性RNA酶活性。同时加入氯仿产生了第二相（有机相），DNA和蛋白质在有机相中被抽提，低pH值的酚将使RNA留在上层水相中。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩,随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，最终获得总RNA。

1.细胞或者组织样品匀浆处理

(1)贴壁培养细胞：细胞量为107,无须用胰蛋白酶消化，在去除培养液后，用预冷无菌PBS洗细胞一次，去上清，再加入1mL单相裂解液裂解细胞，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(2)悬浮培养细胞：细胞量为107,可直接转移到15 mL离心管，500 rpm离心5 min后；用预冷无菌PBS洗涤1次，弃上清，再加入1mL单相裂解液悬浮细胞沉淀，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(3)组织样品：解剖所要的组织后，先将这些组织切成小块（100 mg),然后将组织放入盛有液氮的研钵中，用研棒磨碎组织，使组织成粉末状。在研磨过程中要不断添加液氮使组织保持冷冻状态，最后加入1mL单相裂解液裂解组织细胞，再转移到1.5 mL离心管。

2.RNA提取

(1)样品加入单相裂解液后，室温放置5 min,使样品充分裂解。如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

(2)如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等，12000 rpm离心5 min,取上清。

(3)按每1mL单相裂解液加入200μL氯仿，振荡混匀后室温放置15 min,使其自然分相。禁用旋涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

(4)4℃12 000 rpm离心15 min后，样品会分成三层，黄色的有机层，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。

(5)小心吸取上层水相，至另一个新的1.5 mL离心管中。不要吸取中间界面，以免DNA和蛋白污染。

(6)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，-20℃放置1h以增加RNA沉淀。

(7)4℃12 000 rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

(8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇（用DEPC水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀。

(9)4℃8 000 rpm离心5 min,尽量弃上清。用移液器小心吸弃上清，注意不要吸走RNA沉淀。

(10)室温晾干5〜10 min,让最后残存的痕量乙醇挥发。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

(11)用50μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀，RNA溶液要放在-70℃保存。纯水和TE均需DEPC处理并经高压消毒。

3.RNA定量

RNA提取完就应该来做RNA定量，RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有的吸收峰。因此，可以用260 nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。如用1cm光径，用ddH20稀释DNA样品n倍并以ddH20为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

RNA(mg/mL)=40x(OD260读数）x稀释倍数(n)/1000

纯RNA的OD260/OD280的比值为1.8-2.0,根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值比1.8低，说明有残余蛋白质、酚或者其他杂质存在；比值比2.0高，则提示RNA有降解。

4.RNA凝胶电泳

RNA的电泳目的是检测28S和18S条带的完整性和它们的比值，或者是mRNA Smear的完整性，可以用普通的琼脂糖胶进行。如果28S和18S条带明亮、清晰，没有出现涂抹状片段，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则可判断认为RNA提取的质量是好的。

应用^[7][8]

细胞RNA提取可用于小鼠骨骼肌发育相关环状RNA的鉴定和功能研究：

环状RNA是一种广泛存在于生物界的一种非编码RNA,是mRNA前体选择性剪切形成的产物。环状RNA主要由外显子环化形成,少部分由内含子形成,还有部分由外显子和内含子共同形成。研究表明,环状RNA具有海绵(sponge)作用,充当miRNA的环状抑制剂,调控miRNA靶标发挥作用,参与转录后的调控,进而参与机体的调控功能。以C2C12小鼠成肌细胞为模型,通过芯片筛选出与肌肉发育相关的两条环状RNA--Circ2196和Circ2179,主要研究其对C2C12细胞增殖、分化的影响。实验结果表明Circ2179可以促进细胞的分化,Circ2196可以抑制细胞的增殖。为研究其作用机制,对这两个环状RNA进行细胞定位,发现二者均主要位于细胞质中,为研究环状RNA的海绵(sponge)作用奠定了基础。

参考文献

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[2]Circular RNA:A new star of noncoding RNAs[J].Shibin Qu,Xisheng Yang,Xiaolei Li,Jianlin Wang,Yuan Gao,Runze Shang,Wei Sun,Kefeng Dou,Haimin Li.Cancer Letters.2015(2)

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[7]Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle[J].Jaime J.Carvajal,Peter W.J.Rigby.Experimental Cell Research.2010(18)

[8]钮广林.小鼠骨骼肌发育相关环状RNA的鉴定和功能研究[D].中国农业科学院,2017.