重组人脑源性神经营养因子

脑源性神经营养因子(BDNF)是在神经生长因子被发现后约30年由德国神经化学家及其同事首次从猪脑中分离纯化得到，并发现具有防止神经元死亡效能的一种活性多肽，主要在中枢神经系统内合成，是由119个氨基酸残基组成的小分子碱性蛋白质。 BDNF对多种神经元，如运动神经元、神经嵴及基板起源的感觉神经元、黑质的多巴胺神经元、基底前脑的胆碱能神经元以及海马、皮质、视神经节等处的神经元的生长、分化及损伤后修复有促进作用。这些作用表明，BDNF具有治疗一些中枢神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病的潜力。 将菌体用PBS缓冲液重复洗2次，按1∶ 10悬浮于5 mmol /L EDTA-50 mmol /L Tri s-HCl ( pH8. 0)缓冲液，冰浴超声破碎，离心收集包含体沉淀。用低浓度脲重复洗涤2次，洗涤后的包含体溶解于6 mol /L盐酸胍-50 mmo l /Lβ -巯基乙醇-50 mmo l /L Tris· HCl ( pH8. 0)，1～2 h。再用8 mol /L脲-50mmol /L PB( pH7. 0)透析，以脲替换盐酸胍，经0. 45 μm微孔滤膜过滤后样品上样进行柱色谱。首先，用Wa ters 650 系统和CM-Sepharose FF 柱，收集的rhBDN F峰，用谷胱甘肽系统( 0. 2 mmol /L GSSG-1 mmol /L GSH)复性，复性液中蛋白浓度50～100 μg /ml，pH8. 0，4℃ 12～18 h。复性后样品再用Waters Delta 4 000高压色谱和C8 反相柱( 2 cm× 30 cm) ，进样后，20% 乙腈(含0. 1% TFA)和90% 乙腈(含0. 1% TFA)之间梯度洗脱，流速4 ml /min，收集重组人脑源性神经营养因子峰，冻干。 将纯化得到的重组人脑源性神经营养因子（rhBDNF）作进一步鉴定，包括Western-blot，N-末端氨基酸序列分析及其生物活性的测定。实验结果表明，纯化所得蛋白和抗-hBDNF多克隆抗体有结合特异性，N-末端有一个大肠杆菌系统表达蛋白常见的甲硫氨酸，第14位Cys 在测定条件下被破坏外，重组人脑源性神经营养因子（rhBDNF）-末端序列完全一致。用鸡胚背根神经节法测定其生物活性表明，活性为50 ng /ml。